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标题:【求助】关于BCA法蛋白定量

caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于BCA法蛋白定量


向各位战友请教几个问题：
1酶标仪测定是盖子要不要盖上 ？？
2我们实验室的酶标仪上没有562nm波长的波，最接近的为620nm，还有一个492nm，我们平时做的时候都用这两个中的其中一个，这样对结果会不会有影响？我们的试剂是碧云天的
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们都是不盖盖子的，波长不匹配，无法检测到峰值波长，实验偏倚很大，不可取！加个滤光片吧，或者找个全波长的机子吧！
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于定量我也没有搞懂。
我用的是北京***的BCA试剂盒，要求是562nm，或者是540－590nm之间，可是我们的酶标仪没有562nm，我用的是570nm，盖上盖子的。按说也是可以的。
可是我做出的标准曲线不是直的，稀释后标准品加样在12－20ul时曲线往后勾头，真没搞懂，这是疑点之一。
另外我同学给我一个BCA法试剂盒里面附有的标准曲线图（不是同样公司的），我能否根据她的曲线图，在上面找到我的样品的OD值，然后找到样品的克数？
谢谢了
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12xunmei[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不能用别人的曲线图 必须在同次试验中的曲线才有参考价值
酶标仪的盖子必须盖，否则外面的光透进去会影响读数，但是96孔板的盖子是不盖的
570nm没有问题
标准曲线不直在排除上样量不准的情况下，应该考虑是否超过了有效范围，或是样品总体积的影响
因为不是一样的试剂盒，不知道你们是不是用不同体积的标准蛋白去做曲线，我们的标准品是配成不同浓度的标准品，等体积上样的
如果0－1mg/ml的范围还是直线，2mg/ml出现弯曲，可以考虑舍弃最高浓度的几个值，仅在线性范围内取点做曲线，但注意待测样品也要稀释到相应范围内才能保证精确
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caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了上述几位的解释
还是不明白
似乎都有道理
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caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的标注蛋白按照操作步骤，首先取10ul蛋白标注品（5mg/ml），然后用PBS稀释到100ul（浓度成了0.5mg/ml），然后取0，1，2，4，8，12，16，20ul加到96孔板中，然后再加PBS将所有标准品补足到20ul，这样下来，蛋白浓度分别为0; 0.025;0.05;0.1;0.2;0.3;0.4;0.5mg/ml.这也相当于你说的把标准品配成了不同的浓度，等体积上样。
测的562nm处值分别为0；0.03667；0.076333；0177333；0.305；0.438667；0.3285；0.279，后两个值开始下降了，于是做的标准曲线也是从此处开始往下折去，即在0.4;0.5mg/ml时开始往下折去。如图所示。
另外我的样品是各取了5ml，然后加再PBS将所有样品稀释到20ul。
最后在标准品和样品孔内均加入200ulBCA工作液的，一下操作都相同的
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HP007[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 caihong 于 2014-4-5 22:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了上述几位的解释
还是不明白
似乎都有道理

前面两位解释的确实都有道理，选择波长肯定是越准确越好，但全波长的价格太贵，一般酶标仪检测波长选择有小范围差异还是可以接受的。比如BCA 562nm检测的是峰值，选择570nm所有检测值都略偏小，因为大家都略微偏小因此视为忽略，但波长选择肯定不能差太大，那么检测误差肯定就不能接受。
0；0.03667；0.076333；0177333；0.305；0.438667；0.3285；0.279
前面几个值线性还不错，但最后两个值明显偏低，感觉是你操作问题吧。看看你的BCA试剂说明书检测的线性范围是多少，浓度必需在检测范围内才有意义。我用的是sigma的，你的浓度完全没问题。但考虑就算是超过线性范围，最后3个值应该趋于水平，不应该呈下降趋势啊，所以考虑是否操作出现问题，建议再重复一次。
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caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的操作也许出现了问题，我会重新做一遍。
另外我是按照说明做的，说明书上的线性范围是20－2000ug/ml，所以应该不存在超出范围的问题。
我会重做一遍的，再看看结果。
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-4-5 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加BCA试剂后仔细观察颜色变化没有，在37度孵育后高浓度几个孔的液体性状如何？显色极深？是否有颗粒状沉淀出现？有没有气泡存在？板底是否洁净？
按你的曲线，测吸光度前就应该肉眼可见后两个孔显色浅了吧？当时有考虑原因吗？
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caihong[使用道具]
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 小中大
第一次做，没有仔细观察，用的是一次性的96孔板。我再做一遍看看，多谢啊，真好
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