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标题:【求助】怎么纯化没标签的蛋白?

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-4-8 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎么纯化没标签的蛋白?


小弟最近在纯化个蛋白，蛋白上没有任何标签,我的蛋白PI=4.2,是带负电荷,小弟已经试过好几个柱子了,效果都不好,还是不纯,小弟请教高手有没有方法来纯化没标签的蛋白呢?小弟先谢谢了!
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发表于 2014-4-8 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多用几个柱子纯化，离子交换，疏水层析，凝胶过滤等，想一步就得到纯的蛋白很难。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-8 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把你的操作过程说一遍，从表达到纯化，越具体越好，这种蛋白需要采用多个柱子，进行不同原理的组合操作，很有意思的
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发表于 2014-4-8 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LS的两位说的很对，不带标签的蛋白要纯化，一步到位是很难的，需要摸索多种纯化条件，不止是不同的柱子，同一个柱子也需要尝试不同的条件，盐浓度、pH值、是否添加还原剂等等。
刚开始时条件可以极端一些，有眉目了再具体和细化。
还有，你最好将你蛋白表达与纯化的路线说一下，具体一些，这样大家也好帮助你。
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发表于 2014-4-8 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈哈，如果表达量高、检测方法简单而且特异，可能好做一点儿。
如果表达量不高而且检测方法繁琐、而且要求得到的样品纯度很高，够你摸索学习的了。想简单的很快一两个柱子就搞定似乎不太可能。
如果纯化的目的是做做抗体什么的，建议重新构建带标签的载体，顺利的话两个星期就搞定了，比摸索纯化条件要省事。不过如果你实验有其他要求，不能带标签，还是老老实实做吧。新手的话看看法玛西亚的几本书，有空的话看看chromatography老师的帖子问问不懂的，我想你很快就上道了。但愿你不要想我当初一样像无头的苍蝇浪费太多时间。
深有体会的是：对于刚开始做实验的学生，纯化之前问问老板是不是非得做这个纯化，有没有彼得方法可以代替，因为有的蛋白确实非常难缠，不是书上写的理论的那么简单，万一碰上了，可能一年的时间都没有了。如果非得纯化，能否以表达带标签的方式？最终要多少蛋白？纯度要求多高？
如果必须得干，那就动手吧。
1，检测方法的确立。SDS-PAGE是眼睛，简单，但是不特异。我遇到过明明50kDa的蛋白总是跑在35kDa，浪费了一个月时间。其他的就是WB、酶活等方法了。
2，动手吧。当你看到几万个杂蛋白被你去掉了，然后一条漂亮的单一目的蛋白条带呈现在眼前，很有成就感的。哈哈
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发表于 2014-4-8 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老板说必须要做这个纯化.蛋白要几十毫克吧,....纯度要求95%....我用的载体是PET-30a;这个载体是带His tag标签的,由于实验需要的是不带任何标签的蛋白,所以我把HIS切掉了,表达量还不低,但是纯化都2个月了,条件还是摸不到,蛋白还是老样子,不见明显效果,我用过的好多路线了,有硫酸胺沉淀,(不同浓度剃度),离子交换柱,疏水柱,反向柱,凝胶柱,,,现在我满脑子都乱了,,小弟请教各位老师们有没有非常有效的方法啊?or Protocol,,? 拜托了!
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发表于 2014-4-8 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主都用了这么多方法了，想必也积累了不少经验，恐怕要说清楚也不是一句话两句话的事情，强烈建议参考以下的一些参考书：
1
Methods in Molecular Biology
Vol. 59 protein purification protocols 1st Ed
Vol. 244 protein purification protocols 2nd Ed
2
A Guide to Protein Isolation. ( Dennison)
3
蛋白质纯化和鉴定试验指南
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发表于 2014-4-8 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以先带HIS标签的融合表达，待纯度合格后再用EK把融合蛋白HIS切除，这样纯化应该容易一些吧。或者GST也可以试试。
现在也有很多公司提供蛋白纯化技术服务，也可以让他们帮你做。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-4-8 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上的朋友, 您说的1
Methods in Molecular Biology
Vol. 59 protein purification protocols 1st Ed
Vol. 244 protein purification protocols 2nd Ed
2
A Guide to Protein Isolation. ( Dennison)
现在手头没有这书,在哪下载呢? THANKS!
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-4-8 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老板说必须要做这个纯化.蛋白要几十毫克吧,....纯度要求95%....我用的载体是PET-30a;这个载体是带His tag标签的,由于实验需要的是不带任何标签的蛋白,所以我把HIS切掉了,表达量还不低,但是纯化都2个月了,条件还是摸不到,蛋白还是老样子,不见明显效果,我用过的好多路线了,有硫酸胺沉淀,(不同浓度剃度),离子交换柱,疏水柱,反向柱,凝胶柱,,,现在我满脑子都乱了,,小弟请教各位老师们有没有非常有效的方法啊?or Protocol,,? 拜托了!

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有图片么？我觉得第一步破菌后采用离子交换，或者硫酸铵沉淀后采用疏水。如果做不出来，肯定是操作的问题
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