【求助】PPIC9K载体表达时遇到的细节问题

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标题:【求助】PPIC9K载体表达时遇到的细节问题

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友好：
小弟在用ppic9k做载体，在pichi酵母中表达我的目的酶。现在质粒已经构建好了，并电转到GS115中。经过pcr鉴定，也插入酵母了，而且pcr条带大小正确。现在做表达。先将转化好的酵母，挑一个斑到BMGY培养基中培养至2－5。
请问：
一在这个培养过程中，BMGY中是否需要添加kana或amp抗生素？
二在本版的酵母表达手册中，BMGY的配方中并不含有磷酸钾缓冲液。可是在某外文文献中，BMGY中赫然出现磷酸钾缓冲液。请问到底有没有这个缓冲液？
三这种经过pcr鉴定后的真转化子，是否一定能表达出我的目的蛋白？
请各位战友指教！！

3N4G[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1。我一般采用两级发酵，种子培养，用试管，BMGY，可加相应抗生素（9k应该是G418，因为已经是在酵母里了，kan/amp都是用在大肠筛选的）。摇起来以后，换培养瓶，BMGY或直接BMMY，不加抗生素
2。按照说明书的配肯定没有问题，个人认为加了也不会影响很大，也就是缓冲的作用
3，不一定，需要经过筛选，比如利用G418筛选高拷贝的转化子；而且在众多鉴定正确的转化子中也可能有表达量高低的差别
还有，就是注意是不表达还是表达量低，这个是有本质区别的:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9973153&sty=1&tpg=1&age=0')
祝好运！

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，我不加G418，直接挑斑到BMGY中培养可以嘛？这样会不会导致对应基因的丢失？
2，版主为何采用两级发酵？这样做有什么好的原理嘛？
3，手册中说在BMGY培养至2－5。可是某外文中说培养至5-15.请问到底培养到OD多少后，再进行诱导最好？
4，关于表达量。我在酵母电转的时候，将5ug质粒溶于70ul水中，然后跟80ulGS115混合后电转的。手册中描述说将5－10ug质粒溶于5－10ul水中。那看来我的质粒浓度太低，这样会不会导致很少的重组质粒整合到酵母基因中？加大质粒浓度，会不会得到高表大量的真转化子？
请版主指教，谢谢!!!

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再请问各位战友：
一：手册中描述，在BMGY培养后，再稀释至MM，BMM，或者是BMMY培养基培养。请问这三种培养基有什么区别？还是随便选择一种即可？以前我用的是BMMY，发现转化后的酵母在里面还是生长的非常好！
二：我的GS115感受态细胞，做好了之后，能否先放到零下80度保存？
请各位战友指教，谢谢！！
......

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三种培养基的营养成份不一样，MM应该是最“贫乏”的，生长会很慢，本质都是采用甲醇来诱导，可以三种都试试。
GS115的感受态只能在冰浴里放24h，-80或冰浴时间过长都不行的。最好是现做。

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你的蛋白是分泌表达的话,推荐用BMMY,因为它营养相对较丰富,并且具有缓冲能力,可以抑制一些分泌型的酸性蛋白酶的活性,减少目的蛋白降解的可能性.

douding66[使用道具]
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发表于 2014-4-9 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手你们好：我现在应该做酵母表达了，我用sac1进行的线性化，转化GS115按理说转化子应该是Mut+的比较多，可是我觉得转化子在MM板上长得都不好，怎摸回事？难道都是Muts型？

douding66[使用道具]
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