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标题:【求助】二抗用5％牛奶稀释后，HRP失活？

ha111[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】二抗用5％牛奶稀释后，HRP失活？


买了一家公司的二抗，说明书上也没有说明不可以用牛奶稀释。我就用常规的方法5％牛奶稀释。可是怎么都出不来结果。起先还以为是ECL有问题。后来直接点了二抗压片，发现只要加了牛奶就一点信号没有。用 TBST稀释就没有问题。
不知道大家有没有遇到过类似的情况？
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u234[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的二抗都是用5%的脱脂奶粉稀释的，对我们的结果没有任何影响。
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用5%的脱脂奶粉稀释的二抗直接点到膜上，比较难显色。因为膜对蛋白的吸附是非特异性的，所有蛋白都能结合上去，而你二抗的量相对与5%的脱脂奶粉中的蛋白来说是微乎其微了，它们竞争性吸附到膜上，吸附上的二抗极少，所以能难显色。
你用5%的脱脂奶粉稀释的抗体孵育，那就另当别论了，因为一抗结合抗原，二抗结合一抗，都是特异性很高的，其它蛋白无法结合，所以不会有影响。
所以你说的这样证明二抗被5%的脱脂奶粉灭活，是不可靠的。
你可以把一定量的5%的脱脂奶粉稀释的二抗加在EP管中，再直接加入显色液，看看是否显色，就能判断是否HRP失活了。
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是不会的，除非里面含有较高浓度的叠氮钠，因为大家一般都是用牛奶做稀释液的，从来没有问题啊。
可以试着把二抗加到ECL里，这样可能可以更明显的观察到效果：）如果可以有荧光，在TBS里也没问题，那估计就是牛奶的问题了，但是应该只是个例，
或者换一个牌子的牛奶，或者借一点别人曾今做出来的牛奶，就可以判断出问题了吧，可能有的牌子牛奶质量不可靠
祝你实验顺利奥：）
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

牛奶使HRP失活似乎不大可能，普天之下，有多少人用5％牛奶来稀释二抗。
你看看以下几点：
1.你的奶粉是脱脂的吗？
2.你的奶粉是用TBST配制的吗？
3.你的5％牛奶是新鲜配置的吗？
排除以上因素后，你可以这样操作试一下：
往A离心管（1.5ml的那种）加500 ul的TBST配制的5％牛奶，再加0.1-0.2ul的二抗，往B离心管（1.5ml的那种）加500 ul的TBST，再加0.1-0.2ul的二抗。然后进入暗房，每个管里都加入100ul的ECL的A液和B液，看看两个管是不是都发出荧光。
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莲花白[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

牛奶or脱脂奶粉？
加完二抗有无洗膜？
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remenb 于 2014-4-10 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

牛奶使HRP失活似乎不大可能，普天之下，有多少人用5％牛奶来稀释二抗。
你看看以下几点：
1.你的奶粉是脱脂的吗？
2.你的奶粉是用TBST配制的吗？
3.你的5％牛奶是新鲜配置的吗？
排除以上因素后，你可以这样操作试一下：
往A离心管（1.5ml ...

1.你的奶粉是脱脂的吗？
2.你的奶粉是用TBST配制的吗？
3.你的5％牛奶是新鲜配置的吗？
我都是这样做的。
我做过对照， 以同样的稀释比例，一个用TBST稀释，一个用加了牛奶的TBST稀释，两个都点在滤纸上，TBST中的二抗，荧光很强，肉眼可见。牛奶中的看不到，压片子也看不到黑影。以上实验，同时进行。这样分析下来，不是说明牛奶让二抗失活了吗。当然我用别的牌子的二抗，在牛奶中没有这么问题。
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 youyou99 于 2014-4-10 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该是不会的，除非里面含有较高浓度的叠氮钠，因为大家一般都是用牛奶做稀释液的，从来没有问题啊。
可以试着把二抗加到ECL里，这样可能可以更明显的观察到效果：）如果可以有荧光，在TBS里也没问题，那估计就是牛奶的问题了，但是应 ...

我也一直认为牛奶不会影响二抗，但最近出了这样的事情，让我不得不相信啊。我也是排查了几天才弄清的，起先没有想到牛奶会有问题的。所以和大家来说说。
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发表于 2014-4-10 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们做的是用1％的脱脂奶粉加TBST稀释一抗，二抗。一直都没有问题。据说比直接用TBST稀释一抗，二抗好点。不知道为什么会这样。
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 小中大

我们用5％脱脂奶粉in TBST稀释二抗 没有问题
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