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标题:【求助】2DE,银染怎么胶面上什么都没有啊

911[使用道具]
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1
 

【求助】2DE,银染怎么胶面上什么都没有啊

第二次做二维电泳,还不熟练,怎么后来银染,胶面上什么都看不到啊?之前做过一次 因为有师兄指导,蛋白条带显示出来了,
轮到我自己做,结果什么都没有,
请问有谁遇到过这种情况?会是什么原因呢?
谢谢赐教
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tuuu2[使用道具]
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2
 

太笼统了,你得把你的条件和程序写上来,才好帮你分析!但如果样品是一样的,程序也是一样的话,就很可能是你染色的问题了:加完银后洗涤时间太长会出现这样的情况!
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911[使用道具]
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3
 

恩,
银染: 固定 1h 乙醇:乙酸:水=4:1:5
敏化 30min 34g乙酸钠,1g 五水硫代硫酸钠 150ml乙醇加水到500ml
水洗 3次5min
银染 20min 0.5g硝酸银 加水至500ml
水洗 2次1min
显影 12.48g碳酸钠 200微升甲醛 加水至500ml
银染后水洗时间稍长了些,两次加起来大概4,5分钟,显影8分钟后胶面上还是什么都没有,以前做过的都是2,3分钟都慢慢出来蛋白条带了,我就不清楚是哪步做错了
请问这可能是什么情况阿,像tuuu2说的那样,4,5分钟会不会洗涤时间太长了?
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duoduo[使用道具]
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4
 
恩,
银染: 固定 1h 乙醇:乙酸:水=4:1:5
敏化 30min 34g乙酸钠,1g 五水硫代硫酸钠 150ml乙醇加水到500ml
水洗 3次5min
银染 20min 0.5g硝酸银 加水至500ml
水洗 2次1min
显影 12.48g碳酸钠 200微升甲醛 加水至500ml
银染后水洗时间稍长了些,两次加起来大概4,5分钟,显影8分钟后胶面上还是什么都没有,以前做过的都是2,3分钟都慢慢出来蛋白条带了,我就不清楚是哪步做错了
请问这可能是什么情况阿,像sunrisecau说的那样,4,5分钟会不会洗涤时间太长了?
......

================================================================

从你的步骤看,确实如tuuu2说的那样,银染之后的那步水洗时间太长了。
我一般是银染1h,水洗4次,每次严格控制在1min之内(包含倒水时间)。
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guagua[使用道具]
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5
 

就象楼上这位仁兄说的你的银染后,洗的时间太长啦,每次应该严格控制在一分钟内,再者就是看看你的显影时碳酸钠和甲醇的量没有加错吧,再试试做一遍,祝好运!
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shenkunjie[使用道具]
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6
 

你的蛋白是什么时候抽提的?最好是新抽提的,即使不是新抽提的,也应该在上样前准确定量,如果抽提和定量的时间太长,会有些降解的,那样上样量就不准了,是不会出点的。
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911[使用道具]
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7
 
我上次做的蛋白是新抽提的,
今天准备重复做一次,用上次定量过后存放在—70度冰箱的样品,注意水洗时间控制在1分钟内,另外在配溶液的时候再仔细点,看看这次情况怎么样。
希望能做出来,谢谢大家了:)
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911[使用道具]
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8
 

呵呵,估计上回还是因为水洗时间过长了点,今天上午银染,我定时了严格按照程序上来做的,出来结果了,效果还可以
谢谢大家帮助啦:)
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taoshengyijiu[使用道具]
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感谢楼主反馈信息,能否将前后两次的实验条件及结果的效果(最好有照片)做个对比,分析一下觉得哪个条件的变化对您的结果最有效果,以帮助后来的人学习
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911[使用道具]
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不好意思,图片目前没办法拿上来做比较,
前后两次区别仅是银染时间上的不同,第一次做的时候时间没控制好,所以该敏化半小时的该水洗一分钟的会超时一分钟两分钟的,所以不准确了,后来我听别人讲有人做这个会精确到秒
汗颜,看来以后得细心点
谢谢大家关心帮助,也希望大家吸取我的教训,
祝你们实验成功:)
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