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标题:【求助】浓缩胶凝不了的原因;电泳仪有问题?

nn255[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】浓缩胶凝不了的原因;电泳仪有问题?


最近换了一个实验室做WB,制胶配方没变,各种试剂也是新配的,原来做的是迷你胶,现在做的是大胶.分离胶聚合的时间基本差不多,浓缩胶却很难凝,一个小时后变得稠稠的,还要等好几个小时才能完全凝固(在原来实验室做只要30-45MINS就够了).我试了三次,前两次以为配方有错,今天又做了一次,还是一样.这是为什么?这样配出来的胶能用吗?各位大侠帮忙分析一下吧,谢谢了!
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议最好不要用吧。
不用，废的只是这一块胶；用了，可能废的除了胶，你的样品，还有更多的时间。。。。。
可先检查2点：
1。Tris-Cl缓冲液：时间太长，或pH改变，一定重配。
2。APS：建议重新配一下吧。
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢!我也不敢用.Tris-Cl缓冲液是9月10号配的,我再去测下PH值看看;10%APS是13号配的,保存于4℃,应该是新鲜的吧.为什么分离胶可以正常凝固,而浓缩胶不行?
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是TEMED的量少了呢?
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下午测了下PH值,果然偏差约0.5;原来是PH计不准.重配了下Tris-Cl,分离胶凝得不错,等晚上再看看浓缩胶凝得如何.有一个问题请教各位大侠:
PH值变化是怎么影响胶聚合的?
问题很菜,请大侠们不吝解答,谢谢!
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发表于 2014-4-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也碰到这样的问题.SDS一搅拌就会起很多跑摸，所以我基本都不动,直接把各种试剂加进去,要N长时间才凝.后来稍微搅一下很快就凝了.
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发表于 2014-4-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下午测了下PH值,果然偏差约0.5;原来是PH计不准.重配了下Tris-Cl,分离胶凝得不错,等晚上再看看浓缩胶凝得如何.有一个问题请教各位大侠:
PH值变化是怎么影响胶聚合的?
问题很菜,请大侠们不吝解答,谢谢!
......

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不知LZ重配后浓缩胶凝的怎么样？
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
重配Tris-Cl后,分离胶凝得非常漂亮,浓缩胶也凝了.原来配的Tris-Cl(PH8.8)者PH偏差约+0.5, 6.8者偏差比较大, 约+0.8.为什么PH值会影响胶聚合呢?
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

APS的影响是很大的，前段时间实验室的APS粉末放在室温潮解了，就算是新配APS，胶凝也不佳，而且这样还会导致胶的实际浓度变低。
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-4-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近受人所托, 到另一个实验室教新人做WB;但是我自己才刚学会不久,只有三脚猫功夫,偏偏运气不佳,刚刚开始就接连出问题.
好不容易胶可以凝了,开始上样跑电泳, 用的是六一厂的电泳仪,全新的,没有调试过. 浓缩胶用80V,跑了40MINS, 分离胶用100V,跑了二个多小时才跑到一半.仪表面上显示输出电压99V,电流20MA左右.我加大电压到220V,条带移动的速度跟以前用110V的速度差不多.转膜用110V,60MINS,电流显示为200多MA.转膜结束后,丽春红染色后膜上14-27KD的条带清晰可见,大分子量区条带极淡, 只能隐约看到.这种情况是不是电泳仪有问题?
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