【求助】蛋白表达量太低

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标题:【求助】蛋白表达量太低

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用pet载体在bl21中表达，但是表达量一直不好。只能检测到非常微弱的带。前两天用iptg做诱导，表达量还是没有提高了。
注：我们实验室这个蛋白的表达已经很成熟，而且有一个同学也在用pet和bl21表达他的蛋白，而他的表达量非常好。我们的方法材料试剂都是一样的，只是蛋白不一样。
唉，郁闷呢！！！
谁能帮帮我分析一下。
拨开迷雾见彩虹！

remenb[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先把种子摇到指数生长期（大约两小时到三小时左右），再按一定的比例转接（2%左右）。转接后再摇到指数期加入诱导剂，过夜诱导。我就是这么做的，你试试看行不行:

junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白之间不一样，没有可比性。
表达不好怎么在知道的，检测上清还是whole cell。
是不是包涵体？
你蛋白多大？
什么pet载体？具体哪一个？如果分泌周质空间的一般较低

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 remenb 于 2014-4-10 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先把种子摇到指数生长期（大约两小时到三小时左右），再按一定的比例转接（2%左右）。转接后再摇到指数期加入诱导剂，过夜诱导。我就是这么做的，你试试看行不行: ...

我的种子摇了六小时，而且是全部转接，也是到指数期进行诱导，做了一个过夜的，一个六小时的。效果都不好。
我要试一下你的方案，谢谢你了。我刚开始接触不懂得多，以后多请教了！

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 junjie05 于 2014-4-10 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白之间不一样，没有可比性。
表达不好怎么在知道的，检测上清还是whole cell。
是不是包涵体？
你蛋白多大？
什么pet载体？具体哪一个？如果分泌周质空间的一般较低 ...

蛋白不同可比性不大。
我检测的是理解后的上清，还有裂解后的沉淀，没有检测全菌
我的蛋白是包涵体的可能性比较大（我们头儿说的）
我的蛋白分子量是22kd
我们的pet载体是我们实验室自己构建的，我们的蛋白一般用它来表达。
谢谢你！

remonte[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大肠杆菌不能有效表达，如果工程菌构建、诱导条件都没有问题的话可能是1、你的蛋白本身毒性太大导致表达量降低，此时并非没有表达，而是微量表达以后即可抑制菌体生长，从而使表达总量降低；2、你的基因序列有问题，如含有太多的稀有密码子、mRNA在核糖体结合位点或起始密码子处容易形成发卡结构等，这也可能导致不表达。

pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yapuyapu 于 2014-4-10 15:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用pet载体在bl21中表达，但是表达量一直不好。只能检测到非常微弱的带。前两天用iptg做诱导，表达量还是没有提高了。
注：我们实验室这个蛋白的表达已经很成熟，而且有一个同学也在用pet和bl21表达他的蛋白，而他的表达量非 ...

如果一个pet21可以表达所有的蛋白都很好的话，那为什么还有几十中pet质粒呢？
蛋白表达差异性是非常明显的。
通常情况下更换载体是最明显的，例如你可以换到pet28中，因为他们的酶切位点都一样你可以直接酶切、连接转化就可以了。
另外看看你的蛋白是不是有稀有密码子，如果有可以考虑rosetta。

小糖块[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以先检测一下诱导后的全菌样,如果表达量高说明你在列解的时候蛋白降解了。如果还是表达量太低的话,就首先可以考虑改变诱导条件,诱导剂的浓度\诱导时间\摇床摇的转速都可以改变一下,如果表达量还是很低的话,就可以换载体了,理由呢,楼上说的很清楚了

gogo[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的信息太少啊;
能告诉我们更多的信息,比如什么蛋白啊,标签有否,表达条件等等,那我们大家才能提出些具体的建议啊!!

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我正在优化表达条件，摸诱导表达的条件。下周一就有结果了，到时再把结果告诉大家。
谢谢大家帮我分析，受益匪浅！

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