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标题:【求助】紧急请教糖蛋白糖基化修饰

eve_49[使用道具]
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发表于 2014-4-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】紧急请教糖蛋白糖基化修饰


我需要表达的目的蛋白本来就是糖蛋白，根据糖基化位点要求，我通过碱基突变该变了其两个氨基酸从而另外增加了一个糖基化位点：N-X-T我突变的糖基化位点离该二硫键形成部位较近，有十几个氨基酸。通过CHO细胞表达纯化后与天然的该蛋白一起8％SDS-PAGE还原与非还原电泳鉴定，发现二者的位置相同，有点弥散（可能因为是糖蛋白的缘故）。根据之前预想：如果加上了糖链那么分子量就会增大，则与天然的该蛋白一起电泳就可以鉴别。现在它们在胶上的处于同一位置，这是否说明没有加上糖链？还是因为即使加上糖链后对分子量的影响不足以达到通过电泳看出来？有没有其它更灵敏方法检测？
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发表于 2014-4-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
糖基化是由许多因素决定的，仅靠突变两个氨基酸是远远不够的，除非你的运气太好。所以，你得到相同的蛋白完全是意料之中。

[ 本帖最后由 ffaa 于 2014-4-10 16:18 编辑 ]
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发表于 2014-4-10 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通过软件分析我所突变位点的糖基化机率很高，甚至比该蛋白本身的一个糖基化位点的糖基化机率还高，当然这仅是软件预测而已，经过这几天讨论认为SDS-PAGE胶上不能反应出较小分子量的差别.
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-4-10 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

I think the possible reason is 加上糖链后对分子量的影响不足以达到通过电泳看出来. You could use FTICR-MS or orbitrap-MS to measure accurate molecular weight of the reduced form. If you can not access these high resolution mass spectrometers, you also could digest the target protein and original protein using a enzyme, such as trypsin, then analyze resulting peptides using a low resolution MS to see if there is any differences between them, then verify the difference is glycan. Or you can run a 2D gel, glycoproteins may have different pI.
Anyway, good luck.
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-4-10 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天我打了许多机构（提供MS检测服务）的电话，含糖量在20％下结果才可靠。现在准备用CE，看能否有所进展。另外我能否问你个问题：形成糖链的九种单糖的分子量大概分别是多少？我一直没看见有关方面的文章
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-10 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一个糖链分子量在5kd左右，应该在胶上能看出区别，但是由于你的糖链太多，蛋白带会较宽，所以应该结果可能不太明确。
糖蛋白打质谱结果不准确是因为他们所用的标准内参蛋白不是糖蛋白，而是普通蛋白，糖和氨基酸肯定是有较大差别的。
其实你只管去打质谱就可以了，检测单位的人说的不准确可以忽略掉，因为再不准确也不会超过几百吧，而你加上去的糖链有几千的分子量，再说你有你自己的参照物，所以没突变的和突变的蛋白都拿去打质谱，一对照就知道有没有加上去糖链了。
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-4-10 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我再打电话问问！之前没想到这个糖蛋白的检测这么麻烦．但愿加上糖链了，不知道二硫键（我这个蛋白会通过两个紧邻的二硫键形成二聚体）会不会影响它附近位点的糖基化？如果没有加上糖链，我能想到的原因就只能是这个．书上讲道几乎肽段上糖基化位点一出现在内质网，糖链就会在寡糖转移酶的催化下加上去．但我想内质网里的作为分子伴侣的ＰＤＩ也是在肽链在翻译时就结合上去，帮助形成正确折叠和形成正确二硫键，所以我不知道这二者（寡糖转移酶和ＰＤＩ）会不会在我的目的蛋白翻译后修饰上存在着一定的矛盾．如果没加上糖链，那就有可能是ＰＤＩ阻碍了寡糖转移酶到我所突变的那个糖基化位点，不知道这样分析对不对？请指教．
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发表于 2014-4-10 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

糖基化的原理我没什么研究，不过根据我做蛋白结构的经验，我想应该跟这个位点是否存在于分子表面或者被包埋在分子内部有很大的关系。
如果这个位点暴露在分子表面的话，在折叠中或者折叠完成后就会被加上糖链。
如果被包埋的话，折叠初期就会被包在分子内，寡糖转移酶就会接触不到这个位点。
会不会在还没折叠的时候就加上糖链呢？我认为不会，因为这样就会从一级序列上100％保证了糖基化的实现，实际上并不是这样。
你加的这个糖基化位点离二硫键十几个氨基酸，我觉得单从距离上讲应该够了，但是不能保证他们在分子表面。所以很难说。
如果你做的蛋白的结构已经被解出来了，或者它的同源蛋白已经有结构了，你可以分析或者找出能在分子表面的可能糖基化位点。
这个是PDB库的链接，输入你的蛋白名字搜索就可以了。cuturl('http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do')
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remenb[使用道具]
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 小中大

我所突变的糖基化位点位于分子表面,我在下周去做质谱检测
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