小中大【求助】western blot 的六个小疑问
1。提取的蛋白样品是在三个月不定期进行实验，是-20度还是-80度保存为宜？
2。做好胶后，把梳子的时候始终拔不整齐，是否主要是因为用力不够？各位高人有何心得，清指点下小弟，谢谢。
3。一般来说，电泳和转膜（湿转）buffer的有效期（在实验效果良好的前提下）是多久？or 可以大约做几次？
4。本人做兔子股骨头的HIF-1α，由于需要脱钙，用8%HCl处理了一周，是否对碱性的HIF-1α造成不可逆的变性？还有没可能跑出条带？担忧中。。。
5。显影时间控制在多久范围之内效果较佳？ECL做，第一次通常只要30s,第二次约2min，然后肉眼就见不到荧光了（actin），是否应当继续稀释actin一抗比例？
6。actin的稀释比例是1：8000 ，而HIF-1α一抗是1：100（博士德），二抗1：4000，一抗二抗都是2h,但ECL肉眼不能看到HIF-1α,actin却很亮，此时是否应当一抗过夜？
如上疑问待解答，还望各位高人指点，先***了
