【求助】包涵体洗涤与纯化问题

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标题:【求助】包涵体洗涤与纯化问题

00无名指00[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我表达的是GST融合蛋白，超声后检测发现主要是包涵体形式表达，请问各位，谁有包涵体洗涤与纯化的具体步骤呢？我网上查了有用十二烷基肌氨酸钠法，但是没找到具体操作步骤，哪位知道，给提供下，谢谢啊！

windy+++[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 00无名指00 于 2014-4-12 09:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我表达的是GST融合蛋白，超声后检测发现主要是包涵体形式表达，请问各位，谁有包涵体洗涤与纯化的具体步骤呢？我网上查了有用十二烷基肌氨酸钠法，但是没找到具体操作步骤，哪位知道，给提供下，谢谢啊！ ...

分子克隆上写的很详细.

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果您要做GST亲和纯化,我建议您重新调整表达条件,如果想用包涵体的GST融合蛋白,根本挂不了柱,复性也不行.首先复性率很低,第二复性后与GST亲和柱的结合力也很弱.当然如果你不用亲和纯化,那就无所谓了.包涵体洗涤和溶解的步骤,我们都是采取如下方案:
1.  取保存于－80℃的含原核表达质粒的表达工程菌BL21（DE3）100μL 分别加入5mL加Kan的培养液中（终浓度为80 μg/mL）37℃, 250r/min 振荡培养过夜；
2.  按1：100接种（取250μL过夜培养的菌液接种到250mL LB培养液）37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8之间(约3～4h)；
3.  加入IPTG（终浓度200ug/mL,1mmol/L）（母液为20％IPTG（800mmol/L）），37℃，200rpm振荡培养6h；
4.  取出1mL菌液4000rpm，4℃离心10min收集菌体，SDS-PAGE电泳检测IPTG诱导是否成功。其余菌液4℃保存。如经电泳检测IPTG诱导成功，12000g离心菌体,用0.2%的DOC悬浮,超声破菌；
5.  加 DOC至终浓度2%，充分重悬沉淀，室温下静置至少10min；4℃，13000r/min，离心15min ，重复一次；
6.  加DOC至终浓度为0.2%，混匀，静置10min；4℃，13000r/min，离心15min沉淀包涵体；重复一次；
7.  用含0.6％~1.2% SKL的ddH20充分重悬包涵体沉淀，室温静置4h以上,使沉淀充分溶解；4℃,13000r/min，离心30min，收集上清保存于4℃。 SDS-PAGE电泳检测上清中是否溶解有大量原核表达目的蛋白。

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发表于 2014-4-12 09:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家，我纯化GST融合蛋白用的是sigma产品：glutathione－agarose
这个珠子先与GST融合蛋白结合，然后用还原型谷胱苷肽洗脱。也就是说洗涤溶解并缓冲液透析复性后的包涵体就无法挂在珠子上么？

00无名指00[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这个纯化方法属不属于亲和纯化啊？问题弱弱，实在是不太懂，谢谢了。

00无名指00[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ps：我的后续实验主要是制备特异性抗体，不知表达出来包涵体影响大不？

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

lz提到的就是GST亲和纯化啊, 我也做过这方面的, 就像我前面说的目前复性率一般不超过25%, 而且根本挂不上柱.
推荐两种方法可以解决lz目前的情况.
1.直接包涵体,不用复性,纯化到电泳纯后,1.2%SKL溶解,过G25除盐,调浓度至1mg/mL,直接免疫动物.抗血清收下来,如果你的目标蛋白和GST分子量差很多,那就直接用就好了,如果分子量和GST差不多,就要选择纯化,具体方法您可以上网查一下, 大致就是用目标蛋白溶液包被PVDF膜,再用你的抗血清包膜,最后用酸洗膜,中和洗脱液,就是单独针对目标蛋白的igG了.
2.调整表达条件,低温,增大通气量,短时诱导,多少会有一点在上清中的蛋白,可以通过GST亲和柱浓缩,然后凝血酶作用,除掉蛋白的GST标签.

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很多人说可以直接超声裂解细胞，沉淀重悬后跑SDS-PAGE胶然后在2MKCL里就能见到白色的蛋白条带，然后直接切胶，碾碎后可以混合佐剂也可以不混合佐剂就能直接打抗体了，但是具体操作我还是不怎么懂

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果要胶纯化的话直接加1×loading buffer重悬包涵体沉淀,煮沸10min, 上样就要了, 跑完之后用3M KCl(预冷)染色, 直到看到白色的蛋白带,切下来,由于PAGE本身就可以达到缓慢释放蛋白的作用(佐剂),所以可以不加佐剂,研碎后直接免疫动物即可.
但是KCl染色的灵敏度不是特别好,必须杂带很少,否则染的时候干扰很大.因此使用的不是很多,而且动物对PAGE有一个耐受的上限, 因此抗原的量是有限制的(不能一次打太多的胶), 因此免疫的效果不是很理想.
我曾经看到过一个改良的方法, 试了两三个抗原,免疫的效果还不错.具体的方法如下:
跑PAGE, 考兰染色后,脱色30min, 更换2%戊二醛固定蛋白,室温摇动1~2h即可,然后继续脱色直到蛋白带清晰.切下目的带, 液氮研成粉末, 用佐剂悬浮注射.
这个方法的优点主要在,考兰染色特异性和灵敏度高,这就使得上样的样品不用特别纯, 因为带分的很清楚; 第二就是戊二醛固定, 一方面减少脱色中的损失,另一方面,戊二醛可以起到交联的作用,使小分子抗原交联在一起,增大免疫原性. 如果使免疫小鼠大鼠的话,这个方法是很方便的,但是如果免疫的是兔子或者羊, 还是按照蛋白纯化那条路来吧, 切胶免疫一次出来的抗原不够免疫大动物, 与其跑多次胶免疫, 还不如纯化一批抗原省事,效果也比切胶好.
另注: 小鼠一次注射PAGE胶的最大耐受量是: 50mm3

xyw5[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

强烈同意zhenxin的观点。变性再复性后的效率很低，根本无法挂柱子纯化。