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标题:【求助】急求GTS谷胱甘肽柱操作方法

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发表于 2014-4-12 09:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】急求GTS谷胱甘肽柱操作方法


那位高手有完整的GST柱操作流程啊？我的说明书是英文的，总共几十页马上就要做了，看不过来！请个位战友帮帮忙！先谢过了！
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-4-12 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下是我实验方法：
1.将样品上清与一定体积50%GS4B柱（具体加多少参见说明书）混合，室温充分轻柔混匀半小时。（我用的是杂交箱）。
2.离心700rpm/min左右,4度，5min,弃上清。
3.加10倍柱床体积（指50%GS4B柱体积）预冷的1*PBS清洗柱子，之后离心700rpm/min左右,4度，5min,弃上清。
4.重复3，共清洗3遍。
5.加1倍柱床体积还原型谷胱甘肽置换柱子上结合的蛋白，轻柔混匀10min,室温，离心700rpm/min左右,4度，5min,取上清即可。
6.也可再用还原型谷胱甘肽洗2遍，不过我一般都只洗第一遍。
有什么不妥还请各位指正。
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发表于 2014-4-12 09:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这边也是用离心法做的，但离心是2500R/MIN。好像是低于1000R/MIN效果比较好！10倍柱床洗涤会不会太多了啊？
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发表于 2014-4-12 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多了没事,和一用蔗糖浓缩.
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发表于 2014-4-12 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
参照以下亲和层析原理和方法：
亲和色谱法
一、  基本理论
（一）原理：在生物体内，许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。 2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。
（二）应用范围亲和色谱可用于下列生物体系：酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。
（三）载体的选择原则用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。选择也的配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。
（四）常见载体的特性琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。 纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。
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发表于 2014-4-12 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天做完纯化跑胶后反而没有目的带了，纯化前还有！这是为什么？而且胶回收率很低！
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发表于 2014-4-12 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10倍体积洗涤(wash)不是指洗脱(Elution),洗脱用1-2倍柱体积就可以了。
检验纯化效果如何，电泳要检测原液、流穿、洗脱，安全一点还要取些胶加1×loading处理一起电泳，看目的蛋白在哪个部分。
胶回收率很低的话说明离心取上清操作不小心，或离心不彻底。用柱子会好些。
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 小中大

洗涤时离心是2500R/MIN，洗脱是500G，洗脱时我是用2倍体积的谷胱甘肽！配方是：GSSH 0.156g
50mM TRIS-CL 50ML PH8.0
跑胶也是原液跑的。纯化反而没有目的带了，纯化前还有。会不会是因为胶的丢失而导致蛋白的丢失，但也不可能一点也没有啊？
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发表于 2014-4-12 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白是包涵体吗？你是怎样处理样品的？
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发表于 2014-4-12 10:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天做完纯化跑胶后反而没有目的带了，纯化前还有！这是为什么？而且胶回收率很低！ ???
有图吗?
可能原因:
首先,你这个不是包涵体纯化吧,如果是,那就是你的蛋白复性率太低;
上清纯化:
可能原因:
1.你的柱子不行了,换柱子;
2.你的蛋白降解了,但GST标签应该还是很稳定的啊,你的纯化后也应该看见GST标签蛋白(26KD左右);
3.你的蛋白沉淀在柱子上了,建议下次纯化后电泳涌道加上柱子的样,可以检测你的样在哪一步;
希望能对你有所帮助,按理说GST纯化是很好做的!!
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