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标题:【求助】原核表达时载体与目的片断的连接问题

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达时载体与目的片断的连接问题


我最近在做基因的原核表达，但是目的基因片断和表达载体经酶切后，连接了好多次都没有转化成功，换了好几种连接酶都没用，请各位做过相关内容的朋友给我一点建议和指导！
我连接时目的基因与载体的比例为3：1。
急急急，在线等！
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的什么载体？什么酶？片断是PCR产物吗？
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感受态质量好吗？
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发表于 2014-4-12 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转化的每个环节都不能出错。连接比可以10:1到3:1。
可以电泳检测是否连接上
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leifengta[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种情况根据我的经验，主要是两个环节：
1、酶切的效果不好。
这个你可以通过切载体的时候观察一下，如果能够清晰看到从载体中切出来的外源，说明切开了。因为内切酶经常反复从冰箱中拿出来，容易失效。
2、感受态活性降低了
你可以用很少的质粒做个正对照，看看是不是长的很好，一般来说感受态超过半年活性就要开始下降了。
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发表于 2014-4-12 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 酶是不是过期了？
2. 载体有没有验证可以被单独的酶切开？载体长时间使用会偶尔出问题.
3. 你是没有转化子还是全是假阳性？
4. ligase buffer溶解时会有沉淀，你保温溶解了吗？
5. 回收试剂盒有没有问题，或者有没有什么注意事项没注意？
6. 感受态如何？效价高吗？
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的载体是pET32a（+），KpnI、SacI双酶切，是PCR产物双酶切后与载体双酶切后连接的；
我的感受态是新制备的，应该没有问题；
我的内切酶和连接酶都是新买的，应该没有问题；载体也是新制备的，应该没有问题；我的转化是光板，什么菌落也没长；
请教一下感受态的效价要怎么检测，我的菌株是BL21（DE3).
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好先转化DH5alpha
用空载体检测效价
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先感谢各位的宝贵意见；
我刚开始做原核表达，以前没有做过，请问为什么要先转化到 DH5alpha上呢？
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-4-12 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想您应该先确定几个问题：
1、您的酶切是否完全，我指的是PCR产物，PCR引物添加了多少的保护性碱基，应该使用什么样的酶切BUFFER?因为相对来说比较难从胶上辨别是否酶切。所以我一般在做了1－2次PCR产物酶切连接不成功后，就会先将PCR产物连入T载体，然后再酶切，这样的效果一般很好。
2、感受态细胞的效价有没有问题，应该做完以后做一次转化检测效价。
3、连接完以后，如果您自己认为您做转化的信心不是很高，可以先转化DH5a，因为它的转化效率一般比BL21高上10倍，您可以培养提纯后，再转BL21这样您就可以有很多的载体做试验了，不用天天再重复酶切和连接。
但无论如何还是要设置好对照，对照做好了，解决问题 的速度就更快，排除疑问的速度也快，不过可能相应的工作量就大。看您自己的想法了？
好运!
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