【求助】请教为何出现这样的条带?

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标题:【求助】请教为何出现这样的条带?

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-4-12 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好,我最近在做PCR-SSCP,目的是检测是否存在基因突变,一下是我今天跑的电泳,看到里面有个条带明显和其他的不同,可是不像是突变的条带,所以请各位高手指点一下,为何出现这样的条带.谢谢

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2014-4-12 15:45

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吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-4-12 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有就是两条双链好像分的不是很开,请教各位怎样可以将两条链分开,我用的140v10分钟,90v1个半小时,

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-4-12 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两条链是基本分不开，换大胶跑试一试，
至于第八泳道的条带，也确实不像突变的带，上个帖子中也能反映出来，PCR产物有没有跑过电泳？有图么?
没做过SSCP ，关注中。
楼主上次的帖子，现在条带跑直了，什么原因，可以反馈下。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/9490107')

ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-4-12 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好,我最近在做PCR-SSCP,目的是检测是否存在基因突变,一下是我今天跑的电泳,看到里面有个条带明显和其他的不同,可是不像是突变的条带,所以请各位高手指点一下,为何出现这样的条带.谢谢

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看了一下你的贴，SSCP一般要求在低温情况下跑胶（4－8度），最好选用国外的仪器，如伯乐公司的（有搅拌棒，就不会发生你7.6号发贴的散热不均了，如王版说的胶要配匀，TEMED和AP易失效，尤以AP），在电泳缓冲液要隔断时间看电流大小更换，如平常50V，电流可以达到26－30，一段时间后同样的50V，电流变小，就提示你缓冲液要换了，如没换，就易出现哭脸现象。笑脸现象，可能是电渗造成的。
电渗原理：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
你的目的片断在200－300，银染，没什么杂带，说明你PCR产物很好。但你的MAKER(一般我们不加的）都没怎么跑开，不知道你在多少温度下跑的，跑了多长时间？4度，跑5－6个小时应该没什么问题了。（你胶的浓度12％？胶联度37.5：1吗？）
最好是变性后，立即防冰浴（15－20分钟）这样有助于单链的分开。

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-4-12 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位,我用的是PCR胶回收的产物,跑过琼脂糖电泳的,图如下,我用该产物4ui加4ul变性液沸水浴煮10分钟,立即冰浴10分钟后加样,150v跑15分钟,再改90v跑1个半小时(在冰里面跑的,4度应该可以保证),胶是12%浓度的.还有我的缓冲液是每次更换的,没有重复使用.
上次发帖后经各位指点.我们发现可能是电泳槽下面有气泡造成出现"哭脸"的.现在加缓冲液以后小心排掉底部所有气泡,跑出来的条带倒是比较平,不过也不是完全是很平的线,不知道为何.

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2014-4-12 15:50

83664339.jpg (5.06 KB)