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标题:【求助】western blot结果中的actin怎么了？

cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot结果中的actin怎么了？


6个样品的 caspase-3 条带看起来还可以，而对应的actin 却是很不可思议。问题是：虽然进行蛋白定量，但actin为什么相差那么大，而且很淡呢？


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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

该图就是上面提到的对应actin


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发表于 2014-4-12 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白定量得看你用什么方法，操作上是不是准确，否则也很容易有误差。
此外，你的样品分装好后时间长不长？-20度放几个月，蛋白降解还是比较厉害的。
不知道你的actin条带荧光亮度怎么样？感觉似乎有点象剪的膜条带两端有点翘，导致两端抗体没摇到的情况。所以注意一下，看看一抗二抗是不是浸没条带。此外，也可以稍微加大点actin抗体的浓度。
另：caspase-3最好做剪切条带，做酶原意义不是很大，只有出现剪切条带才能说明有活化。
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是BCA试剂盒来进行蛋白定量的，得到的标准曲线R的平方是0.994。
样品分装后放在-80度保存的，到现在估计一个月了。actin条带的荧光亮度还可以，它的位置在整张膜的中间。caspase-3剪切条带是小分子蛋白，试验条件有什么不同吗？转膜电压、电流什么的。 关于casapase-3做剪切条带，我不十分明白，能够具体点吗？
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上样问题？还是蛋白降解？
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发表于 2014-4-12 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一直用bradford法，自己配的考马斯，效果不错。没用过BCA试剂盒，所以不敢评价，但这么成熟的方法应该不会造成严重的定量不准。
你说荧光还可以，那对于你的actin我还是怀疑摇抗体的时候，膜的两边没怎么摇到，导致两边抗体结合少。所以你要确保整个膜条带能均匀地接触到抗体。
caspase-3你可以跑个15％的胶，然后把6.6KD到35kd范围的条带剪下来，抗体的量可能要多点了（一抗二抗可以重复利用的，其实也不是很费抗体）。如果你显出来了，酶原那个条带浓度下降，而在10 kd或者20kd处出现条带，说明有caspase-3的活化产生。
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的分析和建议。我再做的时候会注意一下摇抗体的情况。
caspase-3的活化确实可以这样证明，这个建议很不错。
我的另一个问题是：caspase-3剪切条带转膜时有没有特殊需要注意的细节吗？
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966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想也可能是你的定量存在问题，
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。你的样品溶解的buffer中可能存在影响定量的成分。
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发表于 2014-4-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该是显色底物没加匀，因为倒数第二个条带一半深一半浅。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-4-12 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
caspase-3的western其实不是特别好做，特别是用santa抗体的。
转膜的时候可能稍微减少点转膜时间。你可以选一个小分子marker，就是有4kd——66kd的那种，这样通过marker可以比较清楚地看到转膜是充分还是过了。
我们周围也有人转膜不加SDS。
我个人的感觉是如果有明显的活化，剪切条带也是比较容易出来的。
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