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标题:【求助】ecl显影后如何处理膜可以再杂交

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】ecl显影后如何处理膜可以再杂交

我想在同一张膜上作两种蛋白的显影，但由于分子量接近不能对一抗进行混合同时显影压片，所以必须对ECL显影后膜进行处理，以便与另一蛋白的一抗反应，但我不是很明白如何对膜进行处理而不影响另一蛋白的显影效果，请高手指点迷津。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

STRIP BUFFER,50-70℃半小时，就可以接着做。
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能不能具体点，我查找的结果是STRIP BUFFER是蛋白洗脱液，不会我的蛋白被洗脱再也不能杂交吧
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我单纯的好奇一下..
为什么不可以分开做呢
我从来没有在paper里看过一张膜上2个不同抗体的图呀..
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IAM007[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.ECL显影后用striping buffer 洗膜.
striping buffer 配方
10%SDS 6ml
0.5mol/LTris-HCL 3.75ml
2-ME 2-巯基乙醇 210ul
双蒸水 20.04ml
2.洗膜后用封闭液封闭.后面就按你原来的步骤做就可以了
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

弱弱的问一下Tris-HCL的PH值是多少，还有需要洗几次，每次洗多长时间？还有其他要注意的吗？
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室一般这样做的:
1, 用ECl发光显影之后,用0.1%的TBS-T(1000mlTBS加入1ml吐温-20,洗膜就用 这个洗的)洗膜3次,每次5分钟,实验室曾经有人一张膜分别显影6个蛋白都没问题;
2,接下来,用你的一抗作用,4度过夜或者37度1~2小时;
3,一抗作用后,用TBST洗膜3次,每次5分钟,然后加入二抗37度1小时;
4,ECL显影,二抗作用后TBSt洗膜3次,然后就可以用ECL发光显影了.
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发表于 2014-4-12 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的方法仅限蛋白分子量差别比较大或者一抗种属不同的情况吧……
如果大小差不多的话 会相互影响的
strip液理论上应该只洗脱与蛋白结合的一抗和二抗，控制好洗脱条件的化结合在膜上的蛋白只会有少量损失，但是依然建议先杂丰度低的蛋白，再杂丰度高的蛋白，洗脱时间和温度也可以适当减少，可参考预染Marker的指示调节
Strip Buffer： 2－ME 800ul， SDS 2g， Tris 0.765g，调节PH值至6.7, 定容至100ml 70度1h，（但有45度15min的报道，我们有时就是60度10min，但最后一种洗脱条件时二次发光如果跟第一次发光的一抗同源，仍可见一次发光时的条带，）可重复使用，Strip后TBST洗两次，30min后封闭及正常的一抗，二抗
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二子[使用道具]
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发表于 2014-4-12 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

并不是说特异性结合的问题 而是strip后或是不strip的话 膜上仍有一抗的结合，同源的二抗在识别一抗的时候是没有特异性的，所以第一次发光时的条带在加上发光液后依然会发光
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