【求助】WB结果负染情况(附图)

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标题:【求助】WB结果负染情况(附图)

wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在心肌组织的蛋白印迹实验中，经过严格的实验步骤，最后经ECL显色，凝胶成像系统照相，出现目的蛋白条带负染情况，MARKER使用的时进口的彩色预染marker，72kd的marker也出现了负染情况。
实验条件：1 、蛋白样品是提自缺血再灌注心肌组织，一直使用，以前从来没有出现这种情况。
2、上样buffer用的是武汉博士德的，2xbuffer。
3 、凝胶用的是10%的sds-page变性凝胶。
4、电泳是100v恒压，跑1小时20分钟。
5 、转膜恒流20毫安，转15小时。（转膜后，膜上可见72kd的maeker）
6 、封闭是5%的脱脂奶粉，产自伊利集团，用tbst稀释，37度侧摆摇床70转，封闭1小时30分钟。封闭完毕洗涤用tbst洗10分钟。
7 、图中第一张膜的一抗是KV-4.2，第三四张膜的一抗是connexin43，第二张膜的一抗是Caspase。一抗孵育是37度侧摆摇床2.5小时。孵育完毕洗四次，用0.05%的tbst洗四次。
8、第一二张膜的二抗同一种二抗，三四张膜是另外一种二抗，都是辣根过氧化物酶标记的二抗，其中一三四张膜出现了负染，第二张膜没出现负染。二抗孵育是37度侧摆摇床1.5小时。孵育完毕洗四次，用0.05%的tbst洗四次。
9 、其中第一三张膜是同一块胶转的膜，分子量分别是72kd（第一张膜）和43kd（第三张膜）。第二四是另外一块胶转的膜，分子量分别是32kd（第二张膜）和43kd（第四张膜）
不知各位实验中是否出现了类似的情况，请各位给分析一下可能的原因，谢谢！！！！！
附图：见附件

附件

2014-4-13 01:27

38045505.jpg (10.63 KB)

txwuyan[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是否是同一批蛋白提?如果不是,1)有可能是提取的蛋白浓度很高,导致上样中目标蛋白也很高,这样容易出现白色条带.
2)也有可能是上样量不一样或者上样缓冲液是加少了,比如说以前是3X的现在是6X的
我做的不多,这些仅供参考!

wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！！！！是同一批提取的蛋白，是第一次做这个目的蛋白，有没有可能是某些厂家的一抗的显色结果就是这样（负染）。

tie8[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

I met this problem once before.
The reason for my experiment was that the secondary antibody concentration was too high. Since then, I always put the minimal recommended concentration of 2' antibody.

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天做实验，也遇到这个问题，整张膜都在发绿色的荧光，洗出来当然是黑色一片。是不是二抗的浓度过高了。我以前也是用的同一个稀释比例，这次还是回收的二抗，为什么出现了这样的问题。

wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位！我今天做的改变了二抗浓度，效果还是不太满意，是不是因为蛋白表达的问题？

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发表于 2014-4-13 01:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 wzqzy 于 2014-4-13 01:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢各位！我今天做的改变了二抗浓度，效果还是不太满意，是不是因为蛋白表达的问题？

How much did you dilute the 2' antibody?
I diluted the 2' antibody at least 10-fold, otherwise you might not see the difference, I think....
ps: you could search "white band" of this forum via the searching box down the following page, hope you can see some good stuff...
cuturl('http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showforum=5')

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发表于 2014-4-13 01:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 tie8 于 2014-4-13 01:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

How much did you dilute the 2' antibody?
I diluted the 2' antibody at least 10-fold, otherwise you might not see the difference, I think....
ps: you could search "white band" of this forum via the ...

1/10?不是建议二抗1：2000吗？你用的什么二抗哦

tie8[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2014-4-13 01:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二抗我使用北京中杉的羊抗兔，建议稀释范围是1比5000-100000，我用的是1比1000，一抗是美国进口的一种钾离子通道蛋白，到今天还是没有出来结果，反而连以前的负染都出不来了，搞不懂!