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标题:【求助】western 为何失败？

duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 为何失败？


各位师兄师姐：
我在做western blot 用底片显色时发现，发现整个底片都是背景，我用的一抗是师姐留给我的，已经两年半了，是否是因为一抗过期，所以western失败了
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idoww[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是封闭没有封好啊？或者二抗浓度实在太高。一抗的话好像一般都不能保存这么长时间的，但是失效应该不是造成高背景的原因吧。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
之前我也考虑了封闭的原因，重做和换人做的是一样的结果，条件是师姐以前摸好的以前都能做出来，但现在总是背景。所以有点头大。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以前封闭后，就放到TBST里稍微洗一下，看实验室其他人封闭后洗10民min*3次效果很好，就跟他们效仿，不知是不是这样把封闭的蛋白又洗掉了，所以造成背景深，请问各位大虾，你们是如何做的
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966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

几乎每一步都可能致错的，所以最好你能把你的实验方案写详细点，这样大家就容易给你找原因了，现在这样太抽象了吧？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我所得电泳时用的是预染marker，可以看到marker条带跑的很漂亮，半干式电转，1平方厘米1毫安稳流三个小时，立春红染色有条带，牛奶封闭两个小时，洗膜，10min*3次，牛奶稀释一抗200倍4度封闭过夜，洗膜，同前，加二抗牛奶稀释2000倍，封闭一小时，暗室显色，加入发光剂后整张膜显萤光，洗出来的底片全黑。不知为何？
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milkdog[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
。。。。牛奶封闭两个小时，洗膜，10min*3次，牛奶稀释一抗200倍4度封闭过夜，洗膜，同前，加二抗牛奶稀释2000倍，封闭一小时，暗室显色，加入发光剂后整张膜显萤光，洗出来的底片全黑。不知为何？

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1，可适当延长封闭时间，不过这不是大问题。
2，封闭液和一抗之间不用洗膜
3，一抗、二抗浓度都过高。是否尝试过1：500或1：1000倍稀释一抗呢？
建议试试：一抗1：1000，二抗：1：10000
4，曝光时间过长也会导致背景高
供参考，注实验顺利
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗二抗浓度都是摸好的，以前做出来过，只是一段时间没做了，一抗就过期了，我重复实验时将封闭时间延长到了三个小时结果还是一样，不知为何？
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cbou876[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加完二抗孵育后，有没有洗涤？不知道你是漏写了还是没有做？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

漏写了，二抗也和前面一样洗了，发光后发现全是荧光后我又洗了两遍还是一样，所以不知怎么办了，各位大侠，帮帮我吧！
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