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标题:【求助】关于原核表达蛋白的肠激酶酶切问题？

鲇鱼少爷[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于原核表达蛋白的肠激酶酶切问题？


最近，在做原核表达蛋白的肠激酶酶切的时候，发现酶切蛋白电泳结果上只有一条我的目的蛋白，融合蛋白Trx不见了。不知道有高人遇到过这样的问题没有？请求帮助！
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鲇鱼少爷[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这蛋白是经过纯化，透析过的，所以在做酶切前蛋白的纯度是有保证的。
不知道什么原因导致蛋白降解的？
还有，就是我一师姐做同样的融合蛋白，在酶切之前保存了一段时间（一天左右的时间），结果也发生降解，而且与我酶切后的降解蛋白是一样大小。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

降解 is usually happen, keep 4C for no more than one week.
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发表于 2014-4-13 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 鲇鱼少爷 于 2014-4-13 20:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近，在做原核表达蛋白的肠激酶酶切的时候，发现酶切蛋白电泳结果上只有一条我的目的蛋白，融合蛋白Trx不见了。不知道有高人遇到过这样的问题没有？请求帮助！ ...


切了后如果两个蛋白（表观）分子量相近，就看不到两条带。如果是这样，你可以load 很小的量，比如20 ng？然后用银染看是否有两条带。或者跑长胶，
个人建议，供参考，
BlessSmile
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有电泳图吗?
一般trx是比较稳定的,不会向你说的这样.
你的目的条带多大?
做western鉴定了吗?
我估计是你的目的蛋白降解了;
还有,你的EK是哪个公司的?要确保没有非特异性降解
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发表于 2014-4-13 20:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有电泳图吗?
一般trx是比较稳定的,不会向你说的这样.
你的目的条带多大?
做western鉴定了吗?
我估计是你的目的蛋白降解了;
还有,你的EK是哪个公司的?要确保没有非特异性降解
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发表于 2014-4-13 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：
肠激酶的对融合蛋白的酶切效果如何？谢谢
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王小主[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EK酶质量很重要。。
蛋白与EK的比例要认真摸索。可以作一个大范围比例看看在哪个范围，再作细化。
已发现EK除了ddddk之外，还有别的识别位点：如LKGDR （
Preparation of recombinant thioredoxin fused N-terminal proCNP: Analysis of enterokinase cleavage products reveals new enterokinase cleavage sites）
如果目的条带切出来之后是沉淀，那就麻烦了。。（俺的就是，没搞定，同求助）
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红袖添香[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的，俺的融合蛋白是凝血酶切的，切完后目的蛋白也出现沉淀了，用了不同缓冲液想重溶，结果都不是很好，痛苦……
还有俺以前有个融合蛋白酶切后，目的蛋白和融合蛋白怎么也分不开，伴侣蛋白倒可以除去，一起来请教大家了……
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sr9971[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

切开之后,目的蛋白是沉淀的话,一般需要改变缓冲条件或者降低酶切温度什么的,或者加大酶量以减少酶切时间,从而使蛋白降低在酶切过程中变性的可能.
还有一种情况,就是你的目的蛋白可能是不可溶的,但是,和Trx蛋白融合表达的时候,由于Trx蛋白的溶解度非常好,Trx就象一个救生圈那样拉着目的蛋白,使其表现为可溶,但是一切开,目的蛋白失去了Trx这个救生圈,就沉淀下来了.
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