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标题:【求助】多克隆抗体纯化

dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】多克隆抗体纯化


各位学长：请教一下，多克隆抗体用什么方法纯化简单操作又能等到高纯度的多克隆抗体
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摆渡客[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

较为简单的方法有两种：
1.硫酸铵沉淀反抽提法，用50％先沉淀（1份100％饱和硫酸铵-预先调至IgG的等电点＋1份抗血清），4度过夜。第二天离心取沉淀，用33％SAS洗涤（1份100％饱和硫酸铵-预先调至IgG的等电点＋2份水），室温放置2小时-洗涤1次，或洗涤两次。处理得好的话纯度可达70％以上。得率也较高。
2.辛酸-硫酸铵法，沉淀时蛋白浓度应为10mg/ml左右，血清蛋白浓度为50mg/ml左右，按照33ul/ml加辛酸。在此浓度的辛酸不会将免疫球蛋白沉淀下来，而会将其它杂蛋白沉淀下来，然后再用一定浓度的硫酸铵将免疫球蛋白沉淀下来，达到进一步纯化的目的，一般为33％的硫酸铵或高一点。处理好的话得率可达80％以上。
另外最好的方法当然是用亲和柱了，用蛋白A或蛋白G亲和柱，得到的纯度很高，但蛋白A不与IgG3结合，蛋白G会与白蛋白结合。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还想请教一下，
1 用抗原耦联CNBr Activated sepharose 4B或用抗原耦联NHS- Activated sepharose进行纯化区别在哪？？
2 用叠氮化钠有什么作用？
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youreyes[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.用叠氮化钠有什么作用？
叠氮化钠是常用的防腐剂，加于抗体中起防腐作用。但若抗体需要进一步酶标的话最好用硫柳汞进行防腐，以免对HRP的活性产生影响。
2. 用抗原耦联CNBr Activated sepharose 4B
是常用的一种方法，特点为比较可靠，反应流程不是很复杂，缺点是会氰化钾有剧毒，对于有些反应得到的耦联抗原键易断裂。再有一点就是CNBR本身就不便宜，国产CNBR最好不要用，活化后的介质基本难于连上配基。
抗原耦联NHS- Activated sepharose
这种抗原耦联方式没有做过，只知道NHS活化的填料,偶联更温和,时间短,可以更好保持活性。
如果偶联小分子的话，NHS-actived sepharose比较好，如果偶联大分子的话，CNBr-actived sepharose比较好，在上免疫亲和层析柱之前最好进行粗提。
另外如果有未端醛基的话，用环氧氯丙烷活化后，再行还原氨化偶联也比较好。
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抗体纯化最简单方便的就是亲和层析了，用PROTEIN G或者PROTEIN A 的亲和柱纯化抗体的效果是非常好的，用抗原偶联的话如果抗原不时很纯的话，纯化出来的抗体纯度是比较差的。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 cwcwcww 的帖子

也想过，PROTEIN G或者PROTEIN A 的亲和柱，也特异性不一定好，只要是他们能结合的抗体都会纯化出来
用抗原偶联的话如果抗原不时很纯的话，纯化出来的抗体纯度是比较差的。 是的，而且蛋白纯化成本也不低，
所以比较矛盾才来请教大家哦
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发表于 2014-4-13 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈哈 我同意辛酸硫酸铵法，简单.便宜.实用，我目前就用它。
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发表于 2014-4-13 20:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是ProteinA和ProteinG不能除去非针对目的蛋白的抗体，比如用重组的带有标签的融合蛋白免疫产生的多抗，如果希望特异的抗体所占比例更大一些，可以先用辛酸-硫酸铵法把抗体沉淀出来，再用抗原偶联法除掉其他抗体
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵请教  辛酸硫酸铵法具体怎么操作？
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chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2014-4-13 20:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果不考虑费用，纯化多抗最好的方法顺序如下
抗原亲和（买填料偶联抗原）纯化>proteinA>proteinG>硫酸铵沉淀>辛酸法
目前用多肽作为抗原进行免疫得到的多抗绝大多数都采用
抗原亲和（买填料偶联抗原）纯化，这个是最好的选择，只有这个方法才能得到高特异性的多克隆抗体，避免其他杂IgG引起的背景！
国外科研多用专门纯化抗体的偶联试剂盒
比如这种 cuturl('http://www.epitomics.com/pdf/6000-1.pdf')
还有pierce公司的产品
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