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标题:【求助】插入基因序列已转录却不表达蛋白的原因？

standup[使用道具]
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发表于 2014-4-13 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】插入基因序列已转录却不表达蛋白的原因？


相关疾病：
单纯疱疹
请教各位老师：我准备研究2型单纯疱疹病毒的复制增殖过程中的一个包装酶。在前期工作中，我已从病毒基因组中获得了目的基因序列，测序分析证实序列完全正确，于是插入pCDNA3.1+质粒中转染Vero细胞，并筛选到数株阳性转染细胞株（抽提细胞基因组进行PCR表明序列已重组入细胞基因组中，RT-PCR实验也表明目的序列在细胞中已进行了转录），可通过SDS-PAGE实验，在细胞裂解物及细胞培养上清中我均未发现相应的蛋白表达。因此，想请教各位老师，基因转录却不翻译表达的原因有哪些？我下面应该怎么办？实验中筛选的阳性转染细胞株还有用吗？
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发表于 2014-4-13 21:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SD序列？移码？表达条件？
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发表于 2014-4-13 21:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有两类情况可能存在.
一是基因确实没有翻译.
另一是翻译了你没有检测到,因为量低.
请分别考虑相应的原因.
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发表于 2014-4-13 21:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白质不表达的原因很多的，也可能是像楼上所说，表达量太低，看不清。这种问题可以采取银染或者WESTERN-BLOT，这两种方法可以检测ng级 范围。如果是真的一点没有表达，可以从以下几个方面来考虑：
1 载体是否适合你基因的表达，可以换几个载体试一试。
2 或者是菌株不适合表达，比如，我以前构建一个质粒，目的基因在DH5a中是不表达的，换了BL21菌株就表达了，而且量很高。
3 看基因是否存在大肠杆菌非偏爱性密码子。
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发表于 2014-4-13 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有本来翻译效率就不高，然后立即被降解了……
不行加点儿MG132，Chloroquin什么的试试
另外，你的WB过程肯定没问题吗？……
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发表于 2014-4-13 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有你的RT-PCR确定没问题，排除基因组DNA污染的可能。
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standup[使用道具]
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发表于 2014-4-13 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位的指点！我会根据各位的指点逐个分析原因，再次感谢！
只是，关于这个蛋白的表达，我已经在上面耗了尽两年的时间，其间我换过多种表达载体（如pQE31，pET22b+，pET30b，pPIC9K，pCDNA3.1+），不同的载体也换过不同的宿主菌（如大肠埃希菌JM109，M15，BL21，Rosetta，Rosetta-gami以及真核表达中的pichia酵母，Vero细胞等），还摸索过不同的表达条件（如温度，IPTG浓度，加葡萄糖等等），可惜始终未得到明显的蛋白表达条带。测序鉴定表明基因序列100%正确，每次变换载体时我都仔细核实避免碱基移码突变。不知以各位的经验，我在这个蛋白上还有必要再做下去吗？是不是有的基因并不一定可以体外表达？但为什么国外表达HSV-1的同一个蛋白酶就有漂亮的结果，而我们只是换成了HSV-2就出问题了，真是弄不明白？
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发表于 2014-4-13 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有你要分析一下你的目的基因的内部结构的复杂程度，如果你表达的蛋白中含有较多的半胱氨酸，容易形成二硫键，这样也不利于基因的表达。即使表达了量也应该很低，或者蛋白没有活性。我以前也做个一段基因的原核表达，换了好多载体也始终未表达出来。不行换其他的真核表达体系试试看。祝你好运。
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vtongli[使用道具]
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发表于 2014-4-13 21:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了同样的问题，那么多少半胱氨酸的含量就算是多呢？
我同时做的两个基因，相同的长度（约1500bp），含12个cys的基因比另外一个含9个cys的基因表达量高出几百倍不止。
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