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标题:【求助】提出的蛋白太黏稠如何做？

dmg[使用道具]
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发表于 2014-4-13 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】提出的蛋白太黏稠如何做？

小弟提蛋白的时候裂解液加少了，结果刮下蛋白后非常黏稠，有点像鼻涕了：（超声6次后离心14000g 6min，根本没有看见沉淀，就是黏稠一团，吸都吸不开。
请问我这个蛋白还能够做WB么？现在已经放入低温冰箱了，能否在做之前拿出来重新超声10次再离心，最后定量呢？
有没有人可以给予帮助
小弟跪谢先啦
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-4-13 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解配方是否含有一些必要的成分，比如说去垢剂，盐离子浓度，蛋白酶抑制剂等,MgCl2 CaCl2等
其他引起粘稠的最主要的原因是核酸和蛋白混在一起，可以试着加点核酸酶，降解掉核酸，释放蛋白。
不过看楼主的描述，我觉得这个“粘稠的鼻涕”，有点夸张啊，超过俺的想象范围，呵呵
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发表于 2014-4-13 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外如果是做WB的话，给个建议，直接将细胞加了SDSpage的loading buffer，超声一下，然后直接加热，让蛋白都变性，离心后就可以上样跑电泳了
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发表于 2014-4-13 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我买的是RIPA裂解液，PMSF的终浓度大于1mM。也不知道是不是由于加少的原因
楼上所说的是另外一种提取蛋白的方法，但是就我这种情况，应该如何补救呢？
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发表于 2014-4-13 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加样品等体积的2X的loading buffer,然后超声，然后煮沸
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发表于 2014-4-13 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦？wawa学长的意思是：下次从冰箱中拿出这次提取的黏稠蛋白，加入上样buffer后再超声？请问这么做的原因是什么呢？如果先超声再离心，然后加上样buffer煮沸与您说的差别在哪里呢？
谢谢赐教：）
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发表于 2014-4-13 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正常得蛋白不会有像你所说得那种“鼻涕”，怀疑你提得蛋白是否是“糖”
造成得原因也不应该是你所说得裂解液+少了造成得
检查你得试验
等你的好消息
good luck!!!!!!
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发表于 2014-4-13 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么会是糖呢？昨天也用这种同样的试剂和方法提就提得很好。应该是密度大的原因，不过肯定是要试一下的。就是不知道到蛋白定量的时候如果吸不上来应该怎么办了？
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发表于 2014-4-13 23:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会是由于裂解液加入的量太少，加上超声波破碎不够，导致核酸没有断裂，与蛋白交缠在一起。
另外如果要做western-blot，建议加完Loading buffer后，上样前高速离心以下，不然的话可能电泳效果很差，反正如果没有溶解在Loading buffer里的蛋白也不能进胶。
good luck！
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dmg[使用道具]
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发表于 2014-4-13 23:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是啊，我觉得是裂解液加入的量太少了，超声了6次，这个应该还是正常。
请问我在加入loading buffer前还能够超声10次再离心然后定量麽？
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