【求助】western blot电泳时分离胶跑的快

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标题:【求助】western blot电泳时分离胶跑的快

abc816[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手，我是新手，刚开始做western，在电泳的时候我用的时间太短了，使蛋白跑不开，怎么办？
积层胶如果电压是90V的话，电流显示为11，用时间为5.5分钟，就要进入分离胶了，分离胶用150V，电流显示为23，最后电流为11，分离胶用时间为27分钟，结束，染色蛋白只在分离胶顶端出现两条带，其他的没有。
我换电压后，积层胶电压是60V的话，电流显示为9，用时间为19分钟，就要进入分离胶了，分离胶用120V，电流显示为17，最后电流为7，分离胶用时间为40分钟，结束，染色蛋白只在分离胶顶端出现两条带，其他的没有。
所用的试剂都是新配的，问题出现在那地方，谢谢帮忙。

birdfish[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不太明白你的意思，既然只在分离胶顶端出现两条带，其他的没有，那么说明蛋白还没有完全跑开，那么为什么不跑得时间长些呢？

vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的经验是刚出分离胶就可以看到预染的marker，而后过程中出现多条不同条带，还算很清楚的，我跑的带至少有五条，在最后一条带未跑出胶之前停止电泳，希望对你有所帮助，我也是新手，共同努力。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的顶部是在哪里啊？
给点参考意见：
1。如果顶部是在浓缩胶和分离胶交界的地方的话，就是你的胶的问题，压胶用水或者异丙醇，不然界面就会干燥而使到蛋白不能通过。
2。如果你说的顶部是在胶的上半部的话，就是电泳得不够。电压够了，延长时间至1小时，看溴酚蓝的位置而定。
3。Marker指示只是一个参考，并不能作为你的电压足够与否的判断标准

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为何那么早结束电泳啊？等溴汾兰到胶底部也不迟。
我们的经验是：浓缩胶用80伏，大约半小时，到分离胶。
然后换电压至120伏，
看到预染maker分离出比较清楚的带（可以不完全保留），让目的带跑到胶的下1/3，分离效果最好。分离胶大约跑1.5-2小时，结束！！！
仅供参考！

BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-4-14 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的样品是多大的分子量啊？可能是胶的浓度大了，样品跑不进。

abc816[使用道具]
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