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标题:【求助】为什么ECL显色，荧光淬灭的非常快？

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么ECL显色，荧光淬灭的非常快？


做WB时，用不同的抗体浓度来摸条件。
在当ECL显色时，发现浓度最高的没有显色，而次高的很亮，但背景的荧光很快就淬灭了，我不清楚怎么回事？
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根本就来不及第二次曝光！！！
高人救我！！！
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yayya[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

显色时，ECL中的A液B液要等体积混合，最好是在暗室里现配现用，根据PVDF膜的大小确定ECL的量，最好不要加太多了，否则容易引起荧光的淬灭。平时ECL最好在4度保存，而且该避光的液体要避光保存。
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那可能是我AB液加多了，我试试看。
感谢楼主
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个应该不是ECL加多的原因，我认为和二抗浓度较高有直接关系。按照ECL发光法的原理来看，AB液其实是提供的发光的底物，在二抗上偶联的辣根过氧化物酶的催化下发出荧光。一般来说发光消耗的是底物而酶原则上是不会被消耗的。因此荧光的迅速淬灭很可能与底物相对较少有关，换句话说就是二抗浓度太高了！
而最高浓度没有荧光很可能是条带区域耗竭过快后反而不如背景的亮，这就是很多失败的WB杂出来负性条带的原因。
最好继续将你的实验具体的浓度发上来，大家讨论，此外你可以将二抗按照5倍的关系倍比稀释，然后在确定稀释度。祝实验顺利！
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这几天我也遇到这种问题了，二抗1：5000，加完ECL后暗室仅能看到部分条带，而且很快就没有了，于是重新洗膜孵育二抗，洗膜，显色，再次曝光结果整张膜都是亮的，也是很快就淬灭了。之前同样条件下不会这样，不知道什么原因？正发愁呢
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
显色时，ECL中的A液B液要等体积混合，最好是在暗室里现配现用，根据PVDF膜的大小确定ECL的量，最好不要加太多了，否则容易引起荧光的淬灭。平时ECL最好在4度保存，而且该避光的液体要避光保存。

==============================================

为什么“最好不要加太多了，否则容易引起荧光的淬灭。”
请教～
谢谢
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小弟显影也遇到一个问题，β-actin单抗，1：1000，二抗平时用1：1000，加400ul混合发光剂才显出很浓的条带。
于是改进，一抗还是1：1000，二抗用1：4000，结果发现加400ul发光剂后，淬灭的更快，有的还显不完全，不知道怎么回事？
请高手执教
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发表于 2014-4-15 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大热天，请大家不要忽略了温度的问题呵呵，当时小弟被这个荧光卒灭害的很惨，后来我采用了两个方法：1，降低2抗浓度：从原来的1：5000降到了1：15000（精美的SB200,地球人都知道吧呵呵），2，暗盒先放4度冰箱预冷
这两个条件改了后，再也没有出现过卒灭的现象。
另外，如果卒灭后，可以把显影过的膜放到tbst中冲洗3－5min，然后重新拿出来加上ecl重新洗片即可。
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的前辈，照你所说，二抗稀释这么大，会不会造成不能发光呢？
我曾经听别人也说过你第二个方法，看来的确会有用哦，顶一个!
下次一定按照你的方法实验
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