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标题:【求助】wb多次如此条带，该如何解决？

newway[使用道具]
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发表于 2014-4-15 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】wb多次如此条带，该如何解决？


条件：5％BSA封闭2小时，一抗4℃过夜，洗膜10分钟×4次，二抗室温1小时。蛋白是刚刚提取的蛋白，蛋白是120kd，跑了多次都是下面样子，同时转膜的内参β-actin条带很漂亮。看下面图（数码相机照的，效果交差），好像没有横向条带，倒是沿着泳道有向下的痕迹，请教是什么原因，已经跑过多次，换过几次条件了，还是不行。


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发表于 2014-4-15 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是另外一次的


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发表于 2014-4-15 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有类似问题，只有在使用某一个抗体的时候才会出现这样的情况，其它抗体都没问题，我现在也没解决，决定换个公司的抗体再试试看。
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baidukk[使用道具]
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发表于 2014-4-15 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

竖向条带是背景
第一张图片下面的片子隐约似乎好像大概是有条带
你的总蛋白上样量有多少？该蛋白丰度如何？
是否有该蛋白的真核表达载体？
如果有干脆过表达一个，确定下一抗质量
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发表于 2014-4-15 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议上样之前先5000 rpm离心，吸取上清上样。感觉如此深的背景是否细胞裂解液中有太多的不溶物质。同时，封闭时间延长，增加二抗的稀释度。
另外，抗体的质量问题也许是最应该让你考虑的。从结果上看，你的抗体的特异性好像不强。虽然不清楚你的具体上样量，但是，按照常规20-50ug的上样量，ELC显影不应该连一个显眼点的条带都没有。我在作iNOS，130KD左右，以前也是遇到过各种问题。你的电泳和转膜条件如何并没有写清楚。你的目的蛋白是否肯定跑进了分离胶？转膜是否充分？内参β-actin分子量那么小，很难说明你的目的蛋白就一定能够做得好。
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newway[使用道具]
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发表于 2014-4-15 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢诸位热心相助。
抗体是santan cruz的，上样量70μg/μL，该蛋白表达量一般，条件：10％分离胶，浓缩胶电压80v，分离胶电压110v，电泳槽放在刨冰中电泳，直至溴酚蓝到胶底部，湿转膜是250毫安，70分钟，转膜完毕后可以看见胶上面的预染marker都转到NC膜上面，应该是转上去了。
背景的确比较深，用过BSA和奶粉，似乎没有大的区别，已经封闭了2小时了，还要延长？关于背景问题，一抗需要稀释吗？二抗稀释加倍？
谢谢
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发表于 2014-4-15 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景深，建议封闭4度过夜，一抗37度一小时就好。另外你的胶上的条带看起来有些弥散，可以考虑适当提高跑分离胶的电压，电压高些，条带压的漂亮些哦。
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发表于 2014-4-15 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量是70ug/ul?还是总上样量是70ug？如果是前者，浓度太高了，分离胶分离不开，到处是拥挤的蛋白，需要稀释5-10倍。（可以跑个SDS-PSGE验证一下，如果条带不清楚，就是浓度太高了）二抗用最大稀释倍数，一抗做个梯度，室温作用1-2h，封闭过夜。
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发表于 2014-4-15 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

santa很多抗体都是垃圾，建议换个公司的抗体
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loli[使用道具]
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发表于 2014-4-15 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我建议你用：１.用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
　　　　　　２.上样量70μg/μL改为：５－１５μg/μL．
　　　　　　３.封闭过夜．
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