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标题:【分享帖】PNAS上一篇关于多拷贝卡那霉素抗性基因与高...

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发表于 2014-4-15 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】PNAS上一篇关于多拷贝卡那霉素抗性基因与高...

这是一篇相当基础的研究论文，做蛋白表达的人大多会用到卡那霉素，在pET30a这样常用的载体上使用的就是卡那霉素的抗性基因作为筛选标记。但可能很少的人会知道卡那霉素的抗性基因是来自一种链霉菌的基因组，并且这种抗性基因在高抗性的菌株中是成百上千存在的，它有复杂的复制机制。这篇文章就成功地揭示了这个机制，并提出了合理的模型，将人们普遍认同的道理用科学的方法证实了。文章所用的实验技术非常简单，工作量也不是很大。文章发表在PNAS，并且一发表就成为NCBI的pubmud上的免费文章，可见其基础研究的重要性。这也提示我们，科学研究并不仅仅在于用先进的手段去研究未知的领域，更可贵的是用现有的简单的手段去解释最简单的顺理成章的道理。
这篇介绍应该发在核酸版上，但核酸版没有Joural club话题，又考虑到蛋白版人气颇旺，所以将此文发在贵版，见谅。


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发表于 2014-4-15 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景介绍
众所周知，微生物可产生大量的次级代谢产物secondary metabolites，所谓次级代谢也就是并非微生物生长繁殖所必须的代谢活动，其产物多是抗生素，色素，毒素，抗癌药物等等。这些次级代谢产物在医药，农业中广泛应用。这些重要的产物往往是通过工业上的发酵得到，由于经济的考虑，要求其发酵产量越大越好。传统上提高产量往往靠经验得到的方法，比如紫外诱变，这些方法如何提高产量的原理和机制却并不知道。


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发表于 2014-4-15 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景介绍
卡那霉素Kanamycin (Km)——一种工业发酵最成功的抗生素，由链霉菌Streptomyces kanamyceticus产生，其命名就来源于其产生菌。
在医药领域中，虽然耐药性问题限制了卡那霉素的使用，但其衍生物amikacin, dibekacin, and arbekacin仍然广泛应用。
为了理性提高其产量并通过基因工程的方法得到新的衍生物，就必须分析它的生物合成基因簇。
生物合成基因簇——一种复杂的代谢产物往往并非一步合成，它由一种或多种底物，通过多种酶一步步反应得到。这些酶往往聚集在基因组的相近的位置，形成一个基因簇。
如果我们掌握了基因簇的序列，分析了其中含有基因的功能，就能了解了产物的酶促反应过程，从而解除限速步骤，得到更多产物，或者可得到中间产物通过代谢工程手段得到新的衍生物。
在以前的工作中，建立粘粒文库，卡那霉素的大部分基因簇已经通过文库得到。Southernblot分析显示，卡那霉素高产菌株中含有多个拷贝的基因簇。


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发表于 2014-4-15 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

结果
1，以前的工作中得到一段4.95-kb SphI fragment 酶切片段，其中含有卡那霉素合成基因(orf20) ，并通过传统诱变方法得到一株高产突变菌株strain 12-1，并将其基因组制成粘粒文库。
用4.95-kb SphI fragment 与文库进行杂交，分别得到两种片段 BamHI fragments (9.6-kb and 10.8-kb) .如图A
图中orf25–32可能是Km基因簇的边界，但高产菌株中同时存在两种片段，预示着可能在此位置发生了基因重组


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发表于 2014-4-15 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

结果
2，重组是怎样进行的呢？
为了搞清这个问题，首先要知道在野生株中Km基因簇的情况。于是作者制作了野生株的基因文库，用4.95-kb SphI fragment 作探针，用染色体步移的方法先后得到Km基因簇左侧13个相关的粘粒并测序，得到了下图，其中的双箭头代表每个粘粒的相关片段，将这段染色体全部搞清了。


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发表于 2014-4-15 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果，突变株的染色体和野生株的完全相同，那么这13个粘粒片段与突变株文库杂交，将都有杂交条带。
事实相反，在4-5到5-13之间的染色体上，出现了差别。
如图，
4-5杂交应得到12.4kb，2-1，1-3，3-7应该有条带，5-13应得5.8kb条带，
实际情况是
4-5杂交得到2.2kb，2-1，1-3，3-7没有条带，5-13得5.8kb条带
由此得出在4-5到5-13之间发生重组，重组位点就是图中的
RsC/RsD


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发表于 2014-4-15 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
通过测序，作者发现了RsC/RsD高度同源的重组位置repeated 38-nt sequence ，实际上，不仅仅是
RsC/RsD发生重组，通过测序又发现RsA/RsB之间的重组位置。6-nt sequence (5-TGGTCC-3)
并且发现了4个repeat区


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 小中大

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发表于 2014-4-15 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

到了最难的部分，大家要仔细看图啊！
下面开始推断重组的过程，并通过Southernblot来验证。
首先看A图，是未发生重组的情况，
如果用A酶切，用B2作探针杂交，（B2的位置在B图中找），会得到511kb，
如果用A+S酶切，会得到138kb，
如果用S酶切，会得到498kb，
再看B图，是发生一次重组的情况，
如果用A酶切，用B2作探针杂交，（B2的位置在B图中找），会得到553kb，
如果用A+S酶切，会得到180kb，
如果用S酶切，会得到532kb，
再看C图，是发生两次以上重组的情况，
如果用A酶切，用B2作探针杂交，（B2的位置在B图中找），会得到553kb，133kb
如果用A+S酶切，会得到180kb，133kb
如果用S酶切，会得到532kb，658，802，934....


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 小中大

Southerblot结果验证了发生大于2次的重组，在D图中换用了一种分离超大片段的方法，竟然得到大于5.7Mb的条带，而其原点处仍有条带，表明其重组发生了n次。


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