蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】western blot 中的脱脂奶粉溶解时是否需要加热？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 17  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】western blot 中的脱脂奶粉溶解时是否需要加热？

nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
1

发表于 2014-4-15 18:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot 中的脱脂奶粉溶解时是否需要加热？

如题，TBST平时保存在4度，用来配5％ 的脱脂奶粉，我发现奶粉并不容易溶解。我溶解时一般加热到50度左右，这样牛奶能完全溶解，封闭的效果还可以。但是最近做PPAR－alpha时，背景总是很高。我怀疑是不是和加热有关。可是不加热溶解的封闭效果更差。很多人说溶解牛奶时不用加热。特向各位过来人求救！而且一、抗体的浓度也不大，我甚至试验过1：5000的稀释度。
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
2

发表于 2014-4-15 18:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，封闭后是否需要用TBST洗呢？我以前一直没有洗，刚刚看到有人说要洗膜。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3

发表于 2014-4-15 18:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TBST可以室温保存，没必要放4度。我们一般是配10XTBS,然后用前配置1XTBS，加0.1% tween-20，这些溶液都可室温保存，效果很好。牛奶不用加热，好像还没听说过需要加热的。用振荡器混匀，静置后，吸取上层封闭。封闭后可以用TBST稍微漂洗一下，防止有些抗体结合到牛奶中的某些不溶颗粒或蛋白上。我们一直做得很好，你可以试试。
顶部
changlhsyo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108899
精华 0
积分 310
帖子 279
信誉分 100
可用分 2204
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
4

发表于 2014-4-15 18:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
37度温箱放15分钟效果很好
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
5

发表于 2014-4-15 18:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

溶解奶粉不必加热。你可以尽量的揺匀，然后放在4度冰箱过夜，接着取上面的液体，下面的含有很多杂质与沉淀，就不要了。这样做出来的牛奶效果很好。
另外，TPBT室温可以放，但前提是经常用。如果不常用还是要放到冰箱里，不然会长霉菌的。
顶部
vtongli[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107987
精华 1
积分 283
帖子 221
信誉分 102
可用分 1926
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
6

发表于 2014-4-15 18:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

脱脂那份不必加热，如果室温很难溶解，你首先要看你配的浓度是否正确，如果还是难容可以在换一种新的脱脂奶粉。至于封闭室温下90min就可以了，另外背景高的原因可能是，你没有充分洗膜，一抗4度过夜孵育，洗膜3X10min，二抗37度一小时，而后洗膜3X5min。还有的原因是你二抗的浓度太大了，我用的浓度一般都是1：8000.
顶部
wanglaoshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77295
精华 0
积分 449
帖子 597
信誉分 100
可用分 3796
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
7

发表于 2014-4-15 18:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的脱脂奶粉应该是具有较好溶解度的~~~如果觉得沉淀太多或者不易溶，最好换个牌子的奶粉为好~~废弃的也不浪费~自己喝~
顶部
u76mp[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107971
精华 3
积分 336
帖子 259
信誉分 106
可用分 2121
专家分 30
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
8

发表于 2014-4-15 18:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
背景高是没洗，要洗三次，一次十分钟
顶部
bangqi_k[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114509
精华 0
积分 254
帖子 247
信誉分 100
可用分 1967
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
9

发表于 2014-4-15 18:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的安怡的脱脂奶粉，封闭很好，是不是你的抗体的问题，有些抗体不纯，背景会很高。
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
10

发表于 2014-4-15 18:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用光明的,很多年了一直用这个牌子,好用,好溶.轻轻晃几下瓶子就溶解了.
顶部
 17  1/2 12››