【求助】western 做了三个月都不出结果

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标题:【求助】western 做了三个月都不出结果

wsll[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，我的WENSTERN做了好几个月都一直没有结果也找不出来问题在那儿，抗体也换了好几种，就是不出结果。我现在都郁闷死了。
我用的是分子克隆的配方15%的胶，转膜300MA,1.5h,出来用丽春红染色也还能看到清楚的条带，用TBST稀释的8%的牛奶封闭4°C过夜，或者37°C1.5h都不行，然后用一抗37°C 1.5h摇，TBST 洗膜6 min*4。二抗37°C 1h摇，TBST 洗膜 6 min*4。加底物避光反应3min,曝光。用的是显影液，定影液，就是石家庄化工厂的那种配方。
每次都是一张大黑膜，连个影都没有。这个以前用国产的抗体做出来过，肯定能有结果，但是换了一种进口的抗体就总也出来不来了，每天被老板数落这么简单一个WENSTERN问题都解决不了~~
哪位高手帮我分析一下，如果解决了这个问题，我一定请吃大餐

glass[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前做出来过，就用以前的方法步骤做嘛！
从Marker看来，PAGE应该没有问题的。
以我的经验，在确保所有试剂没有问题的基础上，建议从以下几个方面改进：
1、降低一抗的工作浓度；
2、减少曝光时间或者从5s-60s摸索；
3、可以尝试DAB法，虽然灵敏度第一点但是如果有反应的话还是很好的。
4、建议加阳性对照。
Good luck！

standbyme[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有没有可能是X光片的问题,我同样遇到过这样的问题,不过后来被证明是片子的事情,换新的试一试,

kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得问题在“大黑膜”这里！
请问，你的大黑膜指的是整张膜都黑呢，还是显影的那块地方黑。
如果是整张膜都黑，那我怀疑你的显影定影液或者胶片有问题。因为一般的胶片都是感蓝的。我不知道有没有感灰的胶片，按常理推测，应该没有。
因为你说用什么化工厂的显影定影配方，我总觉得怪怪的。呵呵。买好一点的吧，至少用10几块一包的专用于医学胶片显影定影的试剂。
如果只是显影的那块黑。那问题可能出在一抗上。因为你原来用的是国产的，现在用的是进口的抗体，可能一开始条件没有摸好，所以导致背景过高，你没有发现条带。或者也有可能是因为现在是夏天，你的膜不小心干掉了，导致全黑的假阳性。
呵呵！

大白菜[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是分子克隆的配方15%的胶，转膜300MA,1.5h,出来用丽春红染色也还能看到清楚的条带，用TBST稀释的8%的牛奶封闭4°C过夜，或者37°C1.5h都不行，然后用一抗37°C 1.5h摇，TBST 洗膜6 min*4。二抗37°C 1h摇，TBST 洗膜 6 min*4。加底物避光反应3min,曝光。用的是显影液，定影液，就是石家庄化工厂的那种配方。
每次都是一张大黑膜，连个影都没有。这个以前用国产的抗体做出来过，肯定能有结果，但是换了一种进口的抗体就总也出来不来了，每天被老板数落这么简单一个WENSTERN问题都解决不了~~
......

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大黑膜？显影过度膜会变黑，可能显影时间太长，或是显影液的配方不太对。如果你条带本身强度比较弱，膜又很黑，显出来的条带会被盖住。
另外你可以尝试下：
1.换用5%的脱脂牛奶，一般protocol上都推荐这个浓度，我也在用；不过这个关系可能不是特别大
2.一抗二抗的孵育时间延长，我有做过一种抗体，要4度孵接近17hrs，然后二抗在室温孵育3hrs。注意孵育时间长的话，TBST洗膜时一定要多洗几遍洗干净，不然背景会高。一般用5min×5。我的抗体也是国外定的，可能是因为我用的细胞目的蛋白表达量比较低，另外抗体效价不高。
3.换用更灵敏的显色试剂盒。比如pierce的supersignal
4.曝光时间增加，压片的时间可以延长到5min，甚至10min或更长

大白菜[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是跟你遇到的是同样的问题，我用的是ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ的抗体，稀释比例是１：４００（说明书上说是１：２００-１０００），二抗是博士德的，１：２０００（１：２０００-４０００），８％的胶，转膜３５０ＭＡ，１.５h，用５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（这个效果肯定比牛奶好吧！）封闭１h，孵一抗过夜，怎么也做不出结果来，郁闷死了！！！！哪位大侠指点一下吧～～～

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BSA/TBST的效果不见得比non-fat milk好，根据不同的抗体而定，具体问题具体分析。一般还是用5%non-fat milk

wsll[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家~~~
我的B-actin能出来，条带也不错，就是我自己的抗体那部分很黑，
所以我觉得应该不是曝光的问题。
应该就出在抗体上，我买的也是SANTA的抗体，他建议1：200~1：1000
我做了三个梯度1：200 1：500 1：1000，三个浓度都是那样黑。然后二抗用的是中衫的用的是1：5000，看来我还没有变过二抗的浓度。我稀释到1：10000试试。
我原来做出来的时候是在原来的实验室，现在我们搬了新的实验室就没出来过，奇怪的是我现在有时候把样品拿过去原来的实验室用原来的抗体还能做出来，但是一到这边就不出来了。我曾经把转膜缓冲液，牛奶，TBST，都拿到原来的实验室做，也都能出来，但是一到自己实验室就又不行了。
转膜的仪器也都一样，而且膜转出来也都挺正常的，如果要是我跑胶的问题应该膜不会转那么正常的啊。
会不会是什么特别诡异的细节问题，不易被发现但是至关重要的环节呢~~~
惆怅中..........

小野花[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三个字：换抗体
santa的抗体做不出来很正常，不要再浪费宝贵的时间了

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发表于 2014-4-15 20:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据我百余次western blotting的体会，我觉得关键是要有好的抗体。商品化的抗体很大一部分在制备、运输过程中不过关，经常有作不出结果的事情发生。我用自己制备的单抗和多抗就几乎没有作不出来结果的时候。还有，一些看起来次要的试剂对于实验结果也是很重要的。western blotting用的封闭液最好用专业的进口的脱脂奶粉，能保证效果，还能节省时间，一般半小时就能达到很好的封闭效果。商品化的ECL有时效果也不尽如人意，我现在都是自己配制，虽然敏感性略弱一些，但是价格便宜，发光时间长，总体效果很好。总的来说，实验不出结果，在保证你的操作过程没有错误的基础上，首先要怀疑试剂质量。

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