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标题:【求助】请教高手关于抗体孵育条件

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-4-15 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教高手关于抗体孵育条件


请教高手高高手，
抗体到底是在室温下孵育好还是4度过夜好？
是在摇床上摇好还是平铺静置好？
我曾经听说，考虑到抗体是活性物质，所以孵育温度要高一点。但是分子克隆上又说要4度孵育
如果放在摇床摇的话，会不会影响抗体和抗原表位的结合？
非常感谢
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发表于 2014-4-15 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您一句：请教高手高高手，就没人敢回答了！我不是高手高高手，仅供参考。事情没有绝对的，到底是室温好还是4度过夜好呢？黑猫白猫抓住老鼠就是好猫！摇床好呢还是静置好？常规的做法是摇床，但摇速很慢。
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发表于 2014-4-15 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4度过夜会好些.可以减少非特异结合!
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idea2011[使用道具]
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发表于 2014-4-15 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抗原抗体之间的反应在温度高的时候肯定是比较快的
举个例子在做wb时加一抗，一般室温反应2小时已经足够，但在4度反应就需要过夜，但4度反应抗原抗体之间的反应是比较充分的，往往结果比较好。也许是因为在温度高时分子活动能力加强，抗体抗原间的接触机会增加，反应比较快，但同时结合的不稳定性也增加，而低温时一但结合，也就比较安静的在一起了，但比较慢。
个人见解，供参考。
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发表于 2014-4-15 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多问一句：如果放在4度静置过夜的话，稀释液中的一抗没有经过摇动，那么打个比方，将抗体看作小圆形的分子，静置后应该沉积下来结合膜上的抗原表位，如果正好某处的抗体较少，而此时由于是静置的，没有经过摇动，其他地方的较多抗体无法流过来结合较少抗体部分的抗原，会不会影响荧光结果呢？
问的比较复杂点，呵呵请赐教哦
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发表于 2014-4-15 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

选择正确的阴阳性血清对于结果的说明更有力
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水母[使用道具]
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发表于 2014-4-15 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做了多次western,阴阳性血清均与目的带反应,且反应强度差不多.条件为4度过夜,后改为室温四个小时结果仍然如此.尝试过减少一抗的浓度由1:50变为1:00阴阳性血清均不反应,现在怀疑的是阴性血清有问题,是从别人要的,现在解决办法是用经典方法鉴定确实的阴性血清再做 western,再看结果吧不知哪些地方想的不周,还望各位仁兄不吝赐教!
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-4-15 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多问一句：如果放在4度静置过夜的话，稀释液中的一抗没有经过摇动，那么打个比方，将抗体看作小圆形的分子，静置后应该沉积下来结合膜上的抗原表位，如果正好某处的抗体较少，而此时由于是静置的，没有经过摇动，其他地方的较多抗体无法流过来结合较少抗体部分的抗原，会不会影响荧光结果呢？问的比较复杂点，呵呵请赐教哦
关于这一点，我是这么认为的，在摇动的过程中，由于液体的流动可以液体中不同层次的抗体都可以迅速的与膜上的抗原作用，应该是使反应的速度加快了，即很快能达到完全反应的阶段，加快了反应的速度，对于亲和力小的抗体应该来说是有一定意义的。所以个人认为在低温时由于反应比较慢，就需要比较长的时间，对于抗体活性不高的情况下由于反应没有达到最大程度，是有可能影响最终的荧光强度的。但这些都是要在具体的实验中观察的。
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