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标题:【求助】GST融合蛋白由可溶表达变为了包涵体，何故？

tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】GST融合蛋白由可溶表达变为了包涵体，何故？


3年前构建的GST融合蛋白表达系统为可溶表达，之前也一直能重复。
最近，在换了一新的酵母提取物配制的YTA后，(表达菌是BL21)目的蛋白始终为包涵体。
想请教大家，你们有无遇到这样的情况？
GST融合蛋白由可溶表达变为了包涵体的可能原因有哪些？？
现在，正重新测序，重新转化，看能否能重复表达出可溶蛋白
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glass[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先考虑一下表达温度，高温37度，菌体生长过快，常会导致包涵体出现。
接种量减低和表达时间减少一下看看。另外你的酵母提取物也可能是影响因素。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
营养过剩
1，表达量过高（营养过剩，表达温度过高，表达时间太长等等）
2，重新转化得菌不一定还能有原先得表现，重新转也许能重新得到可溶表达
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发表于 2014-4-16 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到过啊，可惜到现在也一直解决不了。之前我师姐成功的获得表达产物，并且测定了生物活性。而到我作的时候，表达产物就是以包涵体形式存在，没有生物活性。
按照经验，调整诱导表达时间，温度，IPTG浓度都不行。
祝你好运吧。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个现象比较奇怪，具体两次的诱导条件是不是有什么细节的地方不一样导致诱导结果不同了。建议重点还是看看实测温度和IPTG的浓度。
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tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以前我的表达条件是非常宽松 的
25-40度均是可溶表达，IPTG也无影响
直到最近，先成功重复了3次，第四次换了酵母提取物配制的YTA后（IPTG,Amp可能也换了一批），竟然不可溶了
经测序，目的序列未发生表化
目前，重新转化的重组菌表达出可溶蛋白，但沉淀也有。
另外，遇到一个问题，用谷胱苷肽洗脱的GST融合蛋白，在定量（Brandford.BCA法）时，似乎受到残留的谷胱苷肽的干扰（两种方法测的含量不一样）。
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tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达载体本身会否发生变化？？
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发表于 2014-4-16 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很可能，尤其是培养基其实影响是非常大的，某些小成分的改变就可以使菌的生长状态、表达的产物、次级代谢产物等等产生非常大的变化
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tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这次换了tryptone和yeast extracts, 分别用LB和YTA来 表达，
同时又降低温度表达，
结果又都是可溶表达了！！
我以前的表达条件很宽松的
正分析确切的因素。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-4-16 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tuomu45 于 2014-4-16 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这次换了tryptone和yeast extracts, 分别用LB和YTA来 表达，
同时又降低温度表达，
结果又都是可溶表达了！！
我以前的表达条件很宽松的
正分析确切的因素。 ...

那就请你做下单变量试验确认一下具体的原因吧。
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