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标题:【求助】丽春红 染NC膜,染SDS-PAGE胶都无效

junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】丽春红 染NC膜,染SDS-PAGE胶都无效


配方试过两种
0.1g丽春红溶于5ml乙酸，加入重蒸水定容至100ml。
0.2g丽春红，3gTCA 3g磺基水杨酸，定容至100ml
请高手救命
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

染胶我没试过，但染膜绝对没问题！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是第一种方案，染膜1-5分钟就行，另外你要注意一下膜的正反面，正面往往比反面明显的多。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试过好几次了，然不上啊，奇怪
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那要是染不上的话说明你的蛋白没有转上或者转过了．而且转过的可能性大．染胶用的是考马斯亮兰Ｒ２５０，如果胶上没有膜上也没有就是转过了
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是我做WB做出来了啊，我是做出来以后才去染色的
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bling[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 junjie05 于 2014-4-16 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可是我做WB做出来了啊，我是做出来以后才去染色的

WB做出来后，还怎么能染膜呢？
膜没有条带，是不是一片红啊？因为你已经封闭过的膜，上面都是蛋白了，丽春红再去染色怎能区分目的条带？
封闭原理：占位效应，封闭液（牛奶或BSA）的蛋白结合膜上的未与目的蛋白结合的区域，否则抗体（也是蛋白）会和膜上的其它部位结合的，封闭可以减少非特异性的着色。
所以染膜是在电转之后，封闭之前作的，只要短时间浸泡，双蒸水漂洗几次后再做封闭即可，不影响后面的试验。
染胶没有，是因为胶上的蛋白已经转到膜上了，所以胶上也没有了。
你看看是不是这个原因，祝你一切顺利！
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢老师的帮忙
请问一下，如果我用普通MARKER和NC膜做WB的话，要用什么方法显示MARKER条带
PS:我染胶是电泳后直接染的，时间是10MIn
再请问一下，为什么WB后用考染（PVDF），又能显示条带，难道考不会和封闭液结合吗
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bling[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.普通的Maker显色，一个方法是染胶（考马斯），一个方法是染膜（丽春红），显示MAKER，尤其是染膜后，用铅笔可以做一下标记，再脱色。
还可以买预染MARKER。
2.你是分两块胶跑的PAGE么？我一般是同时跑两块胶，一块用来专门考马斯染色，一块是转膜用。考马斯染后的胶再做免疫印迹不是很好，可能会影响转膜后的与抗体杂交反应，所以不推荐转膜前将胶做考染。
3.“考染（PVDF）”你是指用考马斯染的PVDF膜么？一般都是用考马斯染胶，用丽春红染膜。我没有试过用考马斯染的膜，更没有做过考马斯染WB后的膜，不知道别人这样做过没有。反正我曾经试过把WB之后的膜用丽春红染色，一片红，啥也没有，和封闭有很大关系。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-4-16 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在的WB操作是这样的
电泳，半干转，封闭（脱脂奶粉），一抗，洗膜，二抗，洗膜，显影，考染PVDF膜，定位MARKER
效果很好
可是使用NC膜，用相同的方法，用丽春红染膜染不出来（因为NC膜用考染脱不了色）
还有我做了两次电泳后直接丽春红染胶液染不出来（分别使用一、二配方）
====================
考马斯染后的胶不能直接接着做免疫印迹了吧。
==============================
所以我才打算试一下丽春红染胶在脱色，在转膜
====================
3.“考染（PVDF）”你是指用考马斯染的PVDF膜么？
======================
是的
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