蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 21  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题

wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
1

发表于 2014-4-16 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题


各位前辈高手请指点：
前天，中午11点30杀的大鼠，取脑，人工脑脊液浸泡，4度冰箱保存，下午4点拿普利莱公司的蛋白裂解液做的蛋白提取，以水为对照，电脑测定蛋白含量为— 5.67。（同期，师姐拿新鲜的脑提组织得结果为41。）
考虑是当时冰上裂解时间不够，今天又做了一次，结果基本相同：— 4.65。
问题分析：
1、脑组织不新鲜？？——师姐说虽然组织死掉了，但里面怎么样也该有蛋白呀。
2、保存问题？？——4度条件下，蛋白分解了？？
3、裂解液问题？？——师姐和我几乎同时做的，用的同一瓶裂解液（可提包浆蛋白、核蛋白、膜蛋白），她提出的蛋白测得含量为41。
4、蛋白酶抑制剂问题？？——第一次用的蛋白酶抑制剂确实是有点问题，应该拿异丙醇溶，我用水溶的。我也发现了这一问题，第二次换了另一公司的，经查询确实也是用异丙醇溶，买新的异丙醇溶的。而且根据我查到的资料，蛋白酶抑制剂应该影响不大，很多时候不用都可以提出来。试剂公司的也证实，很多公司生产的蛋白酶抑制剂纯度都不好，加上意义并不大。
5、匀浆问题？？——冰上操作的，时间是匀10分钟，冰上置20分钟裂解。（第一次匀完就离心了，师姐就是那样做的，并没有花时间冰上裂解，一样提出来了）
6、离心问题？？——4度，12000转，5分钟，取上清。
什么问题？？——想破脑袋了。
顶部
yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
2

发表于 2014-4-16 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"电脑测定"是什么意思？你再看看是紫外测定还是考马斯亮蓝测定。
由于你的值是负的，如果用的是考马斯亮蓝测定的话，我想可能你们的蛋白质裂解液里面，或是人工脑脊液里面混入了一些干扰考马斯亮蓝显色的物质。可以检查一下人工脑脊液还有去公司“质问” 一下！
顶部
yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
3

发表于 2014-4-16 11:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑个胶看看吧
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
4

发表于 2014-4-16 11:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电脑测定蛋白含量为— 5.67

===============================================================================================================

即使蛋白有降解或提取过程中有些小问题蛋白也不会测定为负值，你的测量仪可能没有调好，我们实验室曾经有人用波长490（应该为595，加G250)测蛋白浓度出现了负值，后改回来后就正常了，你可检查一下你的染液和所调的吸收光波长是否相符。
顶部
wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
5

发表于 2014-4-16 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位前辈指点，万分感激！！！
我的解释：
“电脑测定”是指我们实验中心有一台全自动蛋白含量测定仪，只需2微升样品滴进测定孔中，1分钟出结果，全自动电脑操作的。紫外测定和考马斯亮蓝测定我还真都没有做过。
我记得那个测定系统可以选择，测蛋白、测PCR或者其他什么，波长什么的是提前就预设好的，并不需要自己调。而且第一次测时，师姐和我几乎同时做的，她的都测出来有41，我的却是负值。
汇报我第三次提的情况：
头两次提组织中的蛋白，我都用的以前的组织，我和师姐分析会不会是组织不新鲜造成的（从杀到提中间过了五个小时，只是一直在冰上放着），昨天周五（2007年6月15日）我又新杀了一只大鼠，拿新鲜脑组织提了一遍，结果仍旧为负值—3.54。师姐跟我开玩笑，说我每次都有进步。我说再提四十次，就会达到30以上的高水平了。
后来下午找到另一位博士师姐，她的意见是：
1、很奇怪，她从来没有碰到过。
2、总蛋白应该很好提，她经常提核蛋白，最低是5，从来没有说是负值的情况。
3、建议我跑个胶看看。
4、因为我和师姐当时用的同样的裂解液，基本可以排除裂解液的问题。
5、因为我和师姐当时用的是不同的蛋白酶抑制剂，建议我拿我师姐的蛋白酶抑制剂试一次。
6、可以让我师姐拿我的东东做一遍，来排除是否试剂的问题还是人为的问题。
综上所述：结合各位前辈的指点，我想下周再做以下尝试：
1、跟师姐商量（注：她不是我亲师姐），是否可以用她的蛋白酶抑制剂，是否可以请她帮忙操作一次。
2、再做一次，分别用新鲜和不新鲜组织提取，完成后测定（我们的测定是老师操作的，我再向他查证下波长的问题（谢谢wgqsdams））测定如果仍为负值，跑胶，用考马斯染下看（谢谢neuronboy和zebrafishtom ）。
思考：
我今天忽然想到一个问题，我是每50mg组织用1ml裂解液，是不是量太大了我查的有关资料是100~150mg组织用1ml裂解液，我有个同学查的资料上是50mg组织用0.2毫升（她还没提过），但我想就算是我用量太多？（但我师姐她们就用这么大量），也不至于产生相反的作用，导致提不出来吧？？
祝各位前辈事事顺利！
顶部
bamboo16[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79663
精华 2
积分 572
帖子 696
信誉分 104
可用分 4391
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态 离线
6

发表于 2014-4-16 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的组织保存液确定没有问题么？我对这个不是太懂，不过你和师姐的差别之一就是这个，值得考虑一下。
另外，裂解液多加应该问题不大的。最多浓度降低。你要是担心的话，降低一半的量试试喽。
另外可以把匀浆裂解的时间延长一点试试看。
你用的是什么蛋白酶抑制剂？
顶部
wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
7

发表于 2014-4-16 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的组织保存液确定没有问题么？
另外，裂解液多加应该问题不大的。
你用的是什么蛋白酶抑制剂？

==========================================================================================

请问您指的组织保存液的问题是什么？？蛋白酶污染？？我用的是自配的人工脑脊液。对，我刚好用完了，下次重新配。
裂解液的问题，试剂公司也是这样的看法。
我用的蛋白酶抑制剂是PMSF（苯甲基磺酰氟）分子量174.19
顶部
wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
8

发表于 2014-4-16 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

晕倒了^
那个上次用我裂解剂的师姐今天又要提蛋白了,我请求她再用我的裂解液试一次,结果她做出来结果不错是19.3。我全程跟踪。基本可以排除裂解液问题，可以排除测试仪问题，同时发现一个重要问题，我匀浆时间很久5——10分钟，她只匀十几下，肉眼看不到组织即停止。置冰上时间也仅5分钟左右（她甚至在实验过程中没有看过表）——当然她主要是为了摸其他的条件，所以她自己也说这次操作不是很严格（所以测出的结果没有上次好。注：上次41.多）
顶部
avi317[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
9

发表于 2014-4-16 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们是提核蛋白么？
裂解液用的什么？
浓度可以达到这么高么
怎么我提处理浓度很低很低？
我也遇到过负值的情况
后来发现是我的标准曲线没有做好的原因
重新做了标准曲线浓度就好点了
但是仍然很低
不知道如何提高核蛋白浓度
我还要提线粒体蛋白
浓度一样很低
真折磨人
顶部
wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
10

发表于 2014-4-16 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们是提核蛋白么？
裂解液用的什么？
浓度可以达到这么高么
怎么我提处理浓度很低很低？
我也遇到过负值的情况
后来发现是我的标准曲线没有做好的原因
重新做了标准曲线浓度就好点了
但是仍然很低
不知道如何提高核蛋白浓度
我还要提线粒体蛋白
浓度一样很低
真折磨人
......

============================================================================================================

我提蛋白用的是普利莱公司的RIPA（裂解液），我师姐用来提膜蛋白，我目前是提总蛋白练练手，RIPA我们这里都比较推荐百*泰*克公司的，我刚学做实验不懂就给买“错”了，不过这个用起来还不错吧，我师姐做了两次，第一次41多，第二次她连称都没称就估了个重量配的液还19多，她的同学送她的比较贵的另一个（好象还是进口货）与我给她的这个同时提的两次一次是20多，一次才3多。当然你可不要被我误导了，总的来说试剂中大多进口的产品比较稳定，出结果又快又好。
核蛋白我也不会提，听说是不好提的。不过我师姐提膜蛋白好象是要变速离心的，你再问下别人吧，核蛋白我有另一个博士师姐提过，她是用试剂盒提的（注：她们博士比我们硕士有钱）。
今天我又请师姐拿我的裂解液RIPA提，我全程观摩。师姐的结果比较理想。可基本排除掉裂解液的问题和检测仪的问题。师姐与我的不同处在于：
1、她的裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂先混匀，然后倒入匀浆器匀。我是分别倒入的。
2、我们用的蛋白酶抑制剂不同。
3、她匀浆时间比较短，只十几下吧，我是5~10分钟。冰上裂解时间也比她长，我是10~20分钟，她是5分钟左右（而且她还没看表，估的）
我明天打算第四次提啦，做一组分别倒入的，做一组裂解时间和师姐一样短的，再做一组不裂解直接离心30min的，如果再不行……我已经让好几个同学在实验室楼下等我了
顶部
 21  1/3 123››