液相色谱

条件：1.C18的反相色谱柱，分析处理甲基丙烯酸酯（MMA），样品中还含有极微量的乙酰半胱氨酸，采用甲醇和水作流动相，样品均溶解在纯水中。每次测样很多，大概有80来个吧。
      2 每次操作也都是将流动相过滤超声后使用。用完后，用5%的甲醇冲洗半小时，再用纯乙晴冲洗一个小时。
      3 因为只是分析甲基丙烯酸酯，标样也就配制了不同浓度的甲基丙烯酸脂。

问题：第一次实验开始用的是新柱子，先做标样MMA，出的峰很漂亮，时间也一致。开始测两样品的时候，出封时间随着测量样品时间的增加，慢慢的会从8min增加到9min。但是峰型还是很尖。
      第二次测试，同样的步骤，但是封出现拖尾，出封时间从9min后移至11min。
      第三次测试，出封在10min，并且基线波动非常大，以至于根本就不能够用了。。

测试的仪器没有控温柱，我怀疑是温度的原因。因为这几天室内温度一只在降低。我只是对MMA进行定量的分析，晚一点点出封，只要和标样时间一致我就觉得可以用的。不知道这样可以不？

关于封拖尾，我觉得是测试时间太长，导致柱效降低。因为第二次试验结束，马上就得第三次实验，我就用5%的甲醇冲洗半小时，再用纯乙晴冲洗一个小时。到第三次实验的时候，峰型图的基线波动十分大的话，我想柱子是不是已经失效了。

我现在想让色谱柱再生。我看了很多再生的资料，都是因为有缓冲盐作流动相后柱子的处理，比如：色谱柱倒置，采用以甲醇:水=95: 5(V/V),纯甲醇，异丙醇作流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍色谱柱体积，然后再以相反顺序冲洗色谱柱。
我样品不含缓冲盐，那么我怎么冲洗改进下更好呢，另外这个再生色谱柱，一定要改变流动相的方向吗？

。。。希望大家指点下。。

[ 本帖最后由 cyp256 于 2010-8-31 13:50 编辑 ]

朋友，把流速提高些

你好。。我测量时流速都是0.8mL/min。
你的意思是每次提高点流速，出峰时间会缩短是吗？

甲基丙烯酸酯这东西在水中的溶解度好吗？样品的基质是否复杂，如果复杂，最好加一保护柱，还有一次性做这么多样，后面的样是不是都在下半夜进样了，昼夜温差大吗？

关于溶解度，我计算过，在我样品测试的范围内事全部溶解的。
样品成分不复杂，第一次测试的时候，出峰还是很干净，分析得很清楚的。
但是后来估计是柱子效果下降，峰很乱，基线也不平了。
昼夜温差有1度，我觉得出峰时间后延和温度有一定关系。但是我只需要确定样品出峰在哪，用面积定量就好了，样品多也得连着测完。

谢谢啦~~

从你几次实验来看,都在9-11分钟,变化不算太离谱,会不会是柱子没有充分平衡?

另外峰形拖尾也许是浓度偏高的原因

不知道你用的啥比例的甲醇和水，保留时间漂移一般是温度的影响，楼主说的峰拖尾估计是有没分离好的组分和主峰重叠。如果流动相里没有缓冲盐只是甲醇和水，用完的话直接用纯甲醇冲掉就可以了，不用先用5%的甲醇冲柱子。再生反相柱子的话，建议楼主用异丙醇反冲柱子过夜即可，流速控制在0.5ml以下。不过按你的说法，是新柱子应该不会是柱子问题。还有，新柱子刚用的时候最好先用甲醇或者乙腈小流速冲半天活化一下，如果上来就用大比例的水相来冲，很容易把固定相冲塌。

我们冲洗柱子的时候一般设置有两个浓度，一个低于洗脱液浓度（即你配置的用于走液相的那个浓度），另一个高于洗脱液浓度。一般来讲，用5%甲醇-水溶液冲洗20min，再用90%甲醇-水冲洗20min，交替两次后，最后柱子保存在100% 甲醇里面，如果不是柱子特别脏不会用乙腈一直冲洗的。如果柱子长时间不用就保存在95%甲醇里。

谢谢！我每次使用前，流动相都会走一个多小时平衡的。。。
开始测量标准样的时候，基线还是很平的，一到测样品就波动大了。

保留时间不停地后移，基线杂峰也增多，都说明色谱柱吸附了脏东西，得好好冲冲。样品基体复杂吗？酯的极性比醇小，很容易吸附在色谱柱上，用四氢呋喃等强的洗脱剂冲柱子试试，反冲是无可奈何之举，楼主最好不要考虑。