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标题:【求助】请问一抗二抗多大比例最好

dog002[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问一抗二抗多大比例最好


各位老师 请问一抗二抗多大比例最好? 刚进实验室,好多都摸不到头绪.
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

每个公司的抗体不一样，所以效价差别非常大，同样一抗，不同公司有1：100的也有1：2000的，即使同一个抗体，不同来源的蛋白稀释比也差别很大。
所以，最好的办法是说明书结合实际情况。
首先，一抗二抗的说明书上都会给一个合适的稀释比，比如santa的会写道（starting dilution 1：200， dilution range 1：100～1：1000），那你就从1：200开始做，如果条带非常明显，那下次可以1：400或者1：500了，如果条带非常淡，可以考虑1：150或者1：100
所以，看说明书很重要，再结合自己的摸索，一般试个1～2次就能摸准了。
good luck
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IAM007[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果在一抗和二抗都不能确定稀释比例的情况下，如何办呢？
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老兄,怎么可能,你买抗体没有说明书吗,自己纯化的抗体呀?即使自己纯化的也可以参照文献啥.
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IAM007[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的意思是假如同时买了一抗和二抗，一抗建议起始稀释比例为1：200，范围为1：200－1：1000，二抗稀释比例是1：2000－1：4000
如果这样的话，应该怎么试？
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗一上来建议浓一点，比如1：200，保证做的出来，如果杂条带比较多或者背景高了可以稀释一抗，1：400或者1：800等等，最佳工作浓度自己摸索一个。二抗一般比较固定，我们实验室都是1：5000。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这边的二抗怎么是1:100,000　作的super ECL的。做出来背景很黑，应该怎么调整呢
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果胶片都很黑的话可能是显影时间长的问题，但如果有非特异性条带则可适当降低一抗的浓度，你的二抗浓度已经比较低了，如果最后发出的荧光持续时间较长的话，还可以酌情减低2-5倍试试。superECL发光是很容易产生非特异性背景的，所以建议把封闭时间延长，并适当减少抗体孵育时间。
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的建议也是一开始做浓度可以高一点
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兔唇[使用道具]
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发表于 2014-4-16 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是应该减少一抗还是二抗的抚育时间呢？我做的是多抗，又是superECL　背景又黑　又有非特异性　真是烦啊。
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