【求助】western发光问题

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标题:【求助】western发光问题

star#room[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我听别人说做western第一次加过发光试剂后，时间不长的话可以第二次加发光试剂，还可以发光。
我最近加过第一次发光试剂后，虽然有光但压片效果不好，又重复加第二次，就不再发光了。
我想知道是发光试剂有问题，还是其他原因。
第一次加的发光试剂到底会不会消耗HRP呢？第二次可以重复加到底有没有道理呢？谢谢！

vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以把发过光的膜用TBST在洗3次,在加发光试剂,是能发光的,我做过的,你也可以用0.2M的ＮaＯＨ溶液洗涤膜５分钟后，在用清水多洗几次，用５％的脱脂奶粉封闭，加一抗和二抗孵育后洗涤，加发光试剂，也可以发光，还可以做其他的转到膜上的蛋白，你可以试一下，我做过的效果还好，祝你好运！

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先说一下发光的原理,发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢.
在辣根过氧化物酶的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种具有发光的电子激发中间体,后者由当激发态返回至基态，就会产生荧光.
在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是作为起催化作用.所以只要HRP没降解没失活,是可以重复加发光液的.
但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的;同时在发光过程中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP.
希望上面的分析会对你的实验有帮助!

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼上的高手，小弟有几个问题请教一下：
1. 发光液一般是分为A.B两种，就像楼上所说是装有不同物质。请问，如果不小心用刚吸过A液瓶的空tip头插入B瓶，但是没有吸取B液，请问这两瓶是否还有用？
2. 第一次显影完后，常规封闭，孵育第二个抗体，当第二个抗体显影时，我发现时常能够把第一个抗体的条带显出来，就是说加放光剂到膜上后，第一个抗体的二抗也能发生反应。请问是不是做过了的抗体，如果没有stripp的话，以后都能够显出来呢？抗体（一抗二抗）是很难洗掉的么？

sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不是楼上那位高手，呵呵，允许我谈谈我得看法，
1 按照化学反应得比例，只有少数A和B反应了，大部分应该还可以用的，如果你不放心，去暗室加少许2抗看看是否有荧光就可以判断了
2 我认为如果不STRIPP的话，单纯用TBST(PBST)洗，把结合在目的蛋白（前一次试验所用抗体）上的抗体洗掉的可能性是不大的。当它遇到相匹配的二抗时，仍可以结合：）
3如果想让杂带消失，就做个STRIPP吧，彻底：）

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢
多问一句：
你的stripp是自己配的还是买的？如果配的是怎么配用？买的话效果好不好？在哪里买划的来？
小弟以前根据网上的配置方法配了stripp用，好像是放50度水浴30min，然后洗15min，再加放光剂后发现以前的所有杂带都没有、
但是，再用这张膜孵育其他抗体就再也出不来了。一连3张膜都是这样，请问你用了stripp后还能够孵育其他抗体么？
谢谢

ending[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

strip的条件有点儿苛刻了
不知道你的配方什么
但是50度30分的话很可能把膜上的蛋白都洗掉了
可以试试减少shtrip时间到10-15分钟左右

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是购买碧云天的,一百多两大瓶,能用怪长时间,操作比较简便,.5分钟就行,感觉效果还行,呵呵,祝实验顺利

ending[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的配方是
β巯基乙醇 700ul
SDS 2g
0.5 M Tris Hcl (PH6.8) 12.5ml
DW 至100ml
我是常温下放置的，不知道哪位高手用过自己配的，渴望得到指点：）

ending[使用道具]
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发表于 2014-4-16 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以把发过光的膜用TBST在洗3次,在加发光试剂,是能发光的,我做过的,你也可以用0.2M的ＮaＯＨ溶液洗涤膜５分钟后，在用清水多洗几次，用５％的脱脂奶粉封闭，加一抗和二抗孵育后洗涤，加发光试剂，也可以发光，还可以做其他的转到膜上的蛋白，你可以试一下，我做过的效果还好，祝你好运！

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我发现发光太强了，于是就把膜拿出放在TBST里泡20秒，发现荧光没有了，就重新加发光剂，可是不管加多少都不发光了，其他同学也是这样。
请问大哥，这种情况是怎么回事？谢谢