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(七)杂交反应时间
在条件都得到满足的情况下,杂交的成败就取决于保温时间。时间短了,杂交反应不完成;时间长了也无益,会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度(Co)和 反应时间(t)的乘积。实验表明Cot =100时,杂交反应基本完成。Cot=0,基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml(按单股DNA每微克 紫外吸收值为0.024计算,总的吸收值为 9.6),如果反应时间为21h,那么对于未标记的DNA来说,Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。对标记DN A(浓度为0.1μg/ml)来说Cot值为0.05,这就充分排除了标记DNA的自我复性。 Tm值25℃时杂交最佳,所以首先要根据公式(4)计算杂交体
Tm 值。由此式可见,通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
(八)杂交促进剂
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小 ,短探针本身的杂交率就高 。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺,平均分子量为500 000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇(PEG),PEG分子量小(6000~8000)、粘度低、价格低廉,但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%~10%硫酸葡聚糖效果较好,若用5%~10%PEG则可产生很高的本底。因此,使用促进剂时有必要优化条件。另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸,用其钠盐,浓度为2%~4%。与硫酸葡聚糖相比,其优点是价格低廉,粘度低(MW=90 000)。小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交,它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂,只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到,该方法曾被称为酚乳化复性技术,该法不能用于固相杂交,因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用,即使在液相杂交中的应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外,该分子还可以促进RNA的杂交,有裂解细胞而抑制RNase的作用。总之,硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
三、主要器材
医用微波炉,恒温水浴箱、湿盒、PNP笔等。
四、试剂
(二) 试剂:
● 2.5ml/L 的醋酸--2.5ml/L醋酸酐:
三乙醇胺 13.2ml
氯化钠 5g
浓盐酸 4ml
醋酸酐(用前加) 2.5ml;
● 20×SSC(pH7.0):
氯化钠 175.3g
枸橼酸钠 88.2g
双蒸水定容至1L;
● 100×Denhardt‘s:
Ficoll 1g
PVP 1g
BSA 1g
ddH2O 定容至50ml;
● 杂交液:(50ml) 用量 终浓度
100%去离子甲酰胺 25ml 50%
100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%
100×Denhard‘s 0.5ml 1
1Mtris-HCL(PH8.0) 0.5ml 10Mm
5M NaCl 3ml 0.3M
0.5M EDTA (PH8.0) 0.1ml 1mM
10mg/ml 变性鱼精DNA 0.5ml 100ug/ml
ddH2O定容至25ml
● 0.1M甘氨酸/PBS:
甘氨酸 7.5g
Na2HPO4 30.8g
NaH2PO4 2.8g
NaCl 8.5g
溶于800mlddH2O,定容至1000ml,高压,室温储存;
●TSM1 (1000ml):
1MTris-HCL(PH8.0) 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 10ml
ddH2O定容至1000ml;
●TSM2 (1000ml):
1MTris-HCL(PH8.0) 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 50ml
ddH2O定容至1000ml;
● 抗体稀释液: 100ml
BSA 1.0g
Tris X-100 0.4ml
叠氮钠 0.4g
0.05M PBS (PH7.2)调至100ml;
● 0.05M PBS (PH7.2):1000ml
Na2HPO4 15.4g
NaH2PO4 1.4g
NaCl 4.25g
●去内源性酶液(40ml):
储存液 用量 终浓度
10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5%
冰醋酸 10.0ml 25.0%
加0.05MPBS至40ml
● 0.4% Triton-X 100
五、操作
(一) 脱蜡,水化:
1、 二甲苯10min 两次
2、 无水乙醇3min 两次
3、95%乙醇3min 一次
4、75%乙醇3min 一次
5、50%乙醇2min 一次
6、重蒸水2min 一次
7、PBS洗涤5min
(二) 将组织芯片放入去内源性酶液中浸泡30min;PBS洗涤5min
(三) 0.1M甘氨酸去游离醛基 15min;0.4%tritonX-100 洗10min;
(四) 用蛋白酶K与37℃孵育30min ,PBS振洗5min
(五) 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ;
(六) 滴加预杂交液42℃,30min;将RNA探针用预杂交液稀释(1ng/uL~2ng/uL)
(七) 杂交
1、在载玻片表面覆盖上杂交小室,加20~50uL的杂交液到组织芯片TMA上,42℃~44℃湿盒中过夜。
2、在4×SSC中37℃洗涤15min
3、2×SSC,加入RNA酶(大致为10ug/ml)37℃中洗涤30min,
4、0.5×SSC,37℃洗涤15min
(八)封闭
1、1%正常山羊血清孵育30min
2、用抗体稀释液稀释碱磷酶标记的抗地高辛抗体(1:500)37℃中孵育3h,PBS洗三次,每次5min
3、TSM1洗;
4、TSM2洗;
(九)显色:用TSM2将NBT/BCIP按2:1稀释进行显色;显微镜下掌握染色程度
(十)终止显色:用水终止
(十一)脱水,透明,封固
1、85%乙醇脱水,2min
2、95%乙醇脱水5min
3、无水乙醇脱水15min
4、二甲苯20min
5、封片,镜检