PCR仪

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

　　在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

　　外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

　　一、 防止RNA酶污染的措施

　　1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

　　2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。

　　3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

　　4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

　　5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

　　6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

　　二、常用的RNA酶抑制剂

　　1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

　　2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

　　3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

　　4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

　　5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

　　mRNA的分离与纯化

　　真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在 20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

　　mRNA的分离方法较多，其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚(dT)纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

　　寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA

　　一、试剂准备

　　1.3M醋酸钠(pH 5.2)

　　2.0.1M NaOH

　　3.1× 上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为 0.1%。

　　4.洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS

　　5.无水乙醇、70%乙醇

　　6.DEPC

　　二、操作步骤

　　1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

　　2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

　　3.使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

　　4.将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。

　　5.将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。

　　6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。

　　7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。

　　8.OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

　　9.4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

　　10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。

　　三、注意事项

　　1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。

　　2.步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。

　　3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

　　4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。

　　5.一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

　　RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：

　　1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。

　　2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

　　3. 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。

　　4. 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

　　5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

　　6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

　　7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

　　RPA的缺点是需要同位素标记探针。

　　

　　一、试剂准备

　　1. GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

　　2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

　　3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml

　　二、操作步骤

　　1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。

　　(1)设计含T7启动子的PCR引物

　　由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:

　　T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

　　引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：

　　上游引物

　　下游引物Ⅱ T7 启动子序列

　　下游引物Ⅰ

　　(2)PCR

　　先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。

　　(3)探针合成标记与纯化

　　在0.5ml 离心管中加入下列试剂：

　　RNasin (40U/μl) 0.5μl

　　GACU POOL GAC

　　(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl

　　[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

　　DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl

　　5×转录 buffer 2μl

　　模板(50ng/μl) 1μl

　　T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

　　混合后，短暂离心，37OC保温1hr。

　　加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

　　加入：饱和酚 50μl

　　氯仿 50μl

　　酵母tRNA(2μg/μl) 4μl

　　DEPC H2O 100μl

　　室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。

　　2.杂交

　　(1) RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

　　(2)取8μl RNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml 离心管中。

　　(2) 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。

　　3. 消化

　　(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。

　　(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。

　　(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。

　　(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。

　　(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。

　　4、电泳与放射自显影

　　(1)配制凝胶：(50ml)

　　40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19：1) 6.25ml

　　5×TBE 10ml

　　尿素 24g

　　加H2O至50ml

　　溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

　　(2)预电泳

　　以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。

　　(3)加样

　　将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳)。

　　(3) 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。

　　三、注意事项

　　1.本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

　　2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

　　3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

　　4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。

　　可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞

　　说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了

　　如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了

　　第二次的引物设计要求可以低一点

　　以50μl体系为例

　　引物各1μl

　　第一次PCR产物5μl

　　二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量

　　我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.