【求助】诱导原核表达

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标题:【求助】诱导原核表达

one[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的实验内容是：诱导原核表达，重组质粒我已经构建好了，载体是PQE30，插入片段约1200bp，菌株是BL21。用IPTG诱导表达。考马斯亮蓝染色，WESTERN-BLOT鉴定。
我现在遇到的问题是诱导表达不出来，已经试了好几次。而且，我们在半年前诱导成功过一次(当时我还是新手,诱导条件是37度,IPTG浓度为1mM,4h,考马斯亮蓝染色鉴定,条带位置正确)。
那位大虾能帮我找找原因呀,我都郁闷的不行了
先谢了

bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

半年前,诱导成功.现在又出来了?那你看看是否是发生了突变了

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

菌种出问题的可能性比较大,活化一下或者重新转化,确保菌种中质粒没有丢失,菌种状态良好

ero11[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这种现象比较常见，主要是菌种的活性降低了。
建议重新提质粒，然后转化。
表达菌株一定要重新做感受态。将提出的质粒转化到新的感受态表达菌株就行了。

one[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家的回帖，质粒我提取酶切鉴定过了，条带位置正确，没有做测序，准备按大家的建议重新转化试一试。
还有我四月份重组的质粒，片断是1100bp，质粒是PET28a,菌株bl21，重组好了以后也尝试诱导表达了几次，也都没有成功，这个是新鲜的，没有多久呀

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有我四月份重组的质粒，片断是1100bp，质粒是PET28a,菌株bl21，重组好了以后也尝试诱导表达了几次，也都没有成功，这个是新鲜的，没有多久呀

=======================================================

测序结果读码框对吗？如果有移码突变就不行了；
稀有密码子多不多？如果比较多可以换宿主菌比如rosseta；
另外外源蛋白如果对宿主有毒性也会导致不表达，可以换宿主BL21PLYS;
还有就是不是所有的基因都能在大肠杆菌里表达的

莲花白[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

表达不出来是很正常的事。。。
并不是什么基因都可以原核表达的。。。。
原核表达的成功与否80％取决于你的基因序列本身。。
偏偏我遇到了一个很恼火的基因。。。
郁闷啊！

vcve[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

曾经在某个Nature protocol的文章上看到一句话，大概就是，
We always use fresh-transformed cells for expression
卖表达菌株的公司说，
Fresh-transformed cells are strongly recommended.

one[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢大家的回帖，我从中学到很多知识
下面向大家汇报一下我这几天的成果，以及我所遇到的新问题：
我在见几天试着用31度诱导，结果在55KD处出现明显的条带，我的目的条带在47KD,
这又是怎么回事呢？

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 one 于 2014-4-19 10:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢大家的回帖，我从中学到很多知识
下面向大家汇报一下我这几天的成果，以及我所遇到的新问题：
我在见几天试着用31度诱导，结果在55KD处出现明显的条带，我的目的条带在47KD,
这又是怎么回事呢？ ...

类似的问题
我做的应该在100KD左右，结果，条带居然在110到120之间出来。如何予以完美解释？

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