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标题:【求助】SDS-PAGE电泳及WB

daod[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE电泳及WB


请问各位WB高手，你们跑电泳时横压时的电压或者横流时的电流一般是多少呢？和胶的浓度有关系么？
我的蛋白分子量120KD，分离胶浓度选在8%，横压跑胶，浓缩胶80v，分离胶130v，3h。转膜半干转，PVDF膜，横流40mA，3h。转完膜胶重新考马染条带变淡。脱脂奶封闭1h，一抗1：500稀释4度过夜，二抗1：5000稀释孵育2h，最后DAB显色，一片空白，好郁闷！请各位帮忙分析原因，我的一抗是中山分装的SANTACRUZE的，会不会是它的问题呢？二抗稀释比例说明书是1：5000-100，000，应该没问题吧。
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE电泳，恒压恒流均可，看个人喜好和经验而定，反正是电压越大，蛋白质迁移速率越大。
周围的同学还是用恒压的多一些。一般浓缩胶电压要一些，60－100V，分离胶120－200V。每种电压的持续时间可通过观察溴酚兰的前沿决定。还有人一种电压跑下来的也可以。
我用的是恒压跑PAGE胶。浓缩胶80V，分离胶150V。
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发表于 2014-4-19 10:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般用60V跑浓缩胶，80V跑分离胶。需要两个小时左右。
也有师兄用80V跑浓缩胶，130V跑分离胶，一个小时内搞定。
结果差别不大，不过电压高点条带会压得比较漂亮，只要不过高。
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发表于 2014-4-19 10:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑多肽的tricine-sds电泳电压一般多少？电压是不是不能上的太高？高了会有什么影响呢？
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daod[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢几位的经验分享，再求教一个问题：胶装好之后可不可以放在4度冰箱过夜存放？还有TBST是要现用现配么？如果PH值良好，放得时间长点可以么？
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果当天来不及做，可以做好胶之后放在4度冰箱过夜， 不过我个人的经验是，重要的样品 还是最好现做现用。 过夜的胶还是多少有点效果不好。
TBST不用每次都现用现配， 我一般是配成 10倍的，放在4度保存，用的时候现稀释1升就可以，几天内就用完了。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
几天就能用完1L的TBST，你的工作量还真大。再请教一个问题：我今天转完膜之后发现膜上有一部分变黄了，跟焦了样，不知道怎么回事。我的蛋白亚基将近130KD，用的横流40mA,转了两个半小时，会不会是电流过大造成的呢？还盼高手赐教。
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hold住[使用道具]
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 小中大

“膜上有一部分变黄了，跟焦了样”
可能是断路了，你放滤纸的时候，是不是没有注意，造成短路了。
我一般是把滤纸剪的稍微小点，防止上下层滤纸接触。
通常 pvdf 膜 〉胶 〉= 滤纸。就可以了。
40mA 电流不大。
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-4-19 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑多肽我的心得是电压不能太高
\我一般100-130(当然指分离胶)
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wood533[使用道具]
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 小中大

经验之谈紧供参考 我通常用70和110了 效果还可以 你可以试一试
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