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标题:【求助】WESTERN图象的显影和定影问题

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WESTERN图象的显影和定影问题

向高人请教——western blotting发光液孵育后有强荧光，在无光源条件下于暗室内可以清楚地看到膜上的条带，但X光片上却没有任何图象。
我们使用的是CELL SIGNALING的发光液。工作液与膜接触后立即发出荧光，条带非常清晰，离工作台稍远也能看得很清楚，但荧光持续时间不长，约5分钟就开始出现肉眼可以察觉地衰减，约20分钟即已淬灭。我们一共压了两张片。第一张曝光约5分钟，显影2~3分钟后定影，看不到任何条带。压第二张片时因为荧光已经开始衰减，延长曝光时间至10分钟左右，显影定影时间与第一次相同，但X光片上仍然没有任何影象。我们对此百思不得其解。向各位前辈专家求助，请大家帮我们找找原因，到底是压片压得不好还是显影定影有问题？（P.S.：我们定影后的X光片都是透明的，这应该是合格的吧？不至于曝光不足吧？）
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
肉眼都能看到荧光,压片应该条带很强的了,是X光片有问题吗?你用的X光片有人用过确定是能用的吗?我们实验室用的柯达的感光片.就是照相馆用的那种
要不就是显影液的问题了,只能一个一个排除,祝你好运了
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 bs4665 的帖子

这么快就有同道回复，真是感动啊……
我们的X光片以前有用过，压得出图象（那次我也在场，看了）。我们前一次实验也用过，虽然当时做得不是很成功，只有些非特异性条带，但也压出来了。所以这次才会觉得头大，不明白为什么会一无所见。
不过也想请问前辈，能不能分享一下压片以及显影定影方面的心得，我们以后也好加以改进。先谢谢你！
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果在暗室肉眼都能直接看到荧光的话，那么问题很可能出在你配制的显影液和定影液上了！
当然，还要排除X片曝光的可能。
不知道你们显影的时候是否有荧光标签？这个可以作为阳性对照（相当于质控）！
这个标签很便宜，但是对于你的显影系统是否正常很有必要，可以检测显影体系是否出现问题。
cuturl('http://www.applygen.com.cn/product.php?cid=21&muluhao=P2010')

描述：
是一种非同位素的自发荧光标签，可粘贴在X-线曝光暗盒内、蛋白或核酸杂交印迹膜上或包被膜的塑料保鲜膜上；曝光显影在X光胶片精确显示一条5厘米长的标尺和文字，帮助指示X-光胶片上的蛋白条带位置、大小，以及指示显影液是否失效。也可用作荧光成像系统的荧光标志或放射科X-线胶片曝光标志。是Western Blot排忧解难的得力助手，并至少可以使用10年以上。
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问这种标签你们有没用过？价格便宜到什么程度？（非常抱歉，你提供的那个链接我无法打开，图片我这里也不知为何看不到，所以没办法自己去看上面的内容。能不能把网页的内容贴在这里？另外就是，在下只是个研究生，钱自然用的老板的经费，不免有所顾虑。请原谅我唐突的问题
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-4-19 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jujuba 于 2014-4-19 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问这种标签你们有没用过？价格便宜到什么程度？（非常抱歉，你提供的那个链接我无法打开，图片我这里也不知为何看不到，所以没办法自己去看上面的内容。能不能把网页的内容贴在这里？另外就是，在下只是个研究生，钱自然用的老板的经 ...


呵呵，记得买成75元。
我用了快一年了，荧光强度一直很好，在白天激发5分钟后即可使用，曝光30秒X片上就非常清晰了


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2014-4-19 17:48
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jujuba[使用道具]
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 小中大

这个……大人请告诉我在哪里有得卖（无法可想了，连广告词也用上）。因为我们实验室是公共实验室，什么专业的人都有，因此并非以WESTERN这类实验为主，公司自然不会很勤快地送目录过来给我们……还望赐教，多谢多谢！
P.S.：劳烦大人把这种产品的完整名称告诉我一下。正如刚才说的，我既开不了网页也看不见图片（你贴的几幅图上好象只有公司的LOGO，不知我有没看错），连产品名称都不知道实在难以购买。再次感谢！
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 小中大
我以前也出现过你同样的问题，肉眼可以看到条带，但是压片什么都没有，而且片子看起来是透明的，没有曝过光的样子。你最好是检查一下你的显影液的使用期，一般来说，不超过6个月（工作液），还要比较低的温度。我们实验室配一批一般使用不超过1个月，如果显影液呈现深红色，则肯定不能用了，立即抛弃。
还有一个可能就是你配显影液的时候出现问题，过于稀释，一般来说浓缩液显影可以在2-3s之内让胶片变黑，我们一般就把这样的显影液按照1：3的比例稀释，然后就能很好的控制显影过程，一般肉眼可看到条带的情况压片10s-30s即可，拿出来显影液中漂洗，一般在红灯下看，最多1min就可以看到条带了。但是，如果你继续稀释显影液，就会需要将胶片泡在显影液中更长的时间，如果你的显影液失效了，你泡半小时也没有用，只会让胶片变得比较黑（仍然透明）。
检查你的显影液，增加显影时间应该能解决你的问题。祝好运！希望及时回馈实验结果。
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jujuba[使用道具]
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 小中大
先谢谢你。
我们这次的情况比较特殊，因为原来的显影液和定影液过期了（之前的实验用感觉还是很好的），订的新的还没到（我们钱不多，买的是国产货，要自己按说明书配的），就问实验室的朋友借了。据她说还是能用的，前几天就压过片，效果良好，不知道为什么过了2、3天而已就似乎失效了。想请教大人：
1、假如将配好的显影液和定影液放在棕色不透明的瓶子里，室温下保存（好象没有刻意放在柜子里避光），会不会失效得快些？你说的比较低的温度大概是多少，能不能说个具体数字？
2、我们这次显影，X光片放在显影液里面2、3分钟都没看到上面有痕迹（在调到最暗的红灯下看。应该没问题吧？但这个时候片子不是透明的，感觉有点像那些没使用过就被放到强光下而曝光的片子。），把片子放进定影液里，立刻就变成均一蓝色透明的（不发黑，整张片最后看起来就完全是一张蓝色的透明塑料片的样子）。这样的情况能不能判断为显影液或者定影液有问题？
3、按照大人介绍的做法，是不是新的显影液配好以后应该拿X光片来试一试，看看要不要稀释？
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发表于 2014-4-19 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 用放射自显影标签是个很好的办法，那个链接是对的，3-5天会到货的
2 过2、3天不会过期的，我的就用了几个月，春节前用到春节后，前后好像有3月余
3 我是室温棕色瓶中放置的
4 根据你的描述，可能是显影液有问题，定影液是好的
5 显影液配置按说明配置，没有特别的
6 你的膜用保鲜膜包起来的，是吧？
7 我的显影液是从大的摄影器材店里买个，两包8元钱，配了1000ml，用了3月余
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