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标题:【求助】western问题请教

笨鸟321[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western问题请教


我最近做western，转膜后用立春红染色可见条带，应该没有问题。然后5％脱脂奶粉封闭1h，1：1000一抗过夜（chemicon公司），TBST4×10min洗膜，1：5000二抗1h，TBST4×10min洗膜，加发光试剂，压片显影定影。但每次都有很深的背景，压片2min可以稍稍看到浅的条带和背景，压片10min则全是背景黑色。我也有试过其他的一抗二抗浓度，但都是运气好压片时间短一些能看到浅的条带和背景，时间长了只有一片黑色了。而且我的发光试剂好像每次加在膜上过了十几分钟就没用了。我试过重复加发光试剂，但第二次加就一点光都没有了。
我觉得一抗二抗浓度我已经调整过一些了，但从来都是有背景在，会不会是发光试剂有问题呢？
第一次在这里发文章，麻烦大家多给我意见啦，谢谢！！！
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不排除发光试剂有问题。
另外建议封闭过夜，一抗二抗分别1h就够了。
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笨鸟321[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为我原来做过western是封闭1h，一抗过夜的，没有什么问题。我也听说过封闭过夜的，所以后来我也试过室温封闭三个小时还是不行。
还想问下如果发光试剂有问题，真的会导致整张膜发光吗？
还有PVDF膜不同厂家会不会有问题呢？我用的是amersham的膜。
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为还是一抗浓度的问题！
背景深的关键性因素！
在WB中一抗的工作浓度要比二抗重要的多，所以建议降低一抗工作浓度！
另外，一抗孵育时间减少，37度30min足矣；而封闭overnight应该会对你的实验结果有帮助。
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笨鸟321[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用现在的一抗浓度，压片2min，蛋白条带和背景都不亮，可以隐约看到，但压片10min就一片黑色了。我还试过更低的1：2000一抗浓度，但压片的时候就见不到任何条带了……
我可能描述的比较乱，麻烦大家了！
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说一下我的看法:
背景深的原因有以下几个原因:其一,二抗浓度过高,这是最常见的原因,解决的办法是降低二抗的稀释比例,或者增加洗膜的次数和时间,从你的实验过程来看,好象不是洗膜不充分!其二,二抗的质量不好,我试过,中杉分装的二抗可以杂交出条带,但是如果你想通过延长暴光时间,就会出现你说的现.而我用santacruze的原装二抗,同样时间暴光,却没有浓黑的背景,所以二抗的质量你不得不考虑!其三显影液质量不好,如果你是用的pierce的ECL,那应该不会有问题,我们一直就是用的这个,但是你用其他国产的,那就不保证了.以上就是我个人的观点,希望对你有帮助!
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-4-19 20:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其三发光试剂质量不好,如果你是用的pierce的ECL,那应该不会有问题,我们一直就是用的这个,但是你用其他国产的,那就不保证了.以上就是我个人的观点,希望对你有帮助! 刚才说错了!更正一下!
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