蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【分享帖】蛋白质电泳电转时的几个新招,不看后悔

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【分享帖】蛋白质电泳电转时的几个新招,不看后悔

雪花子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72953
精华 1
积分 259
帖子 194
信誉分 102
可用分 1776
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
1
 

【分享帖】蛋白质电泳电转时的几个新招,不看后悔


以前在国内做western blot的时候,在做电转的过程中,发现实验手册上的一些要求比较难以达到,比如做“三明治”夹膜的时候,书上要求滤纸和胶以及PVDF膜必须精确对齐(并且据说是如果不对整齐的话会导致短路,使蛋白不能转移到膜上),并且没有气泡,这样就让人不得不把膜夹好后,还要拿起来用剪刀把滤纸等的多余出的部分进行修剪,但做过的人都知道,这是个费力不讨好的活,经常是剪不整齐,而且会导致本来没有气泡的膜反而会带入新的气泡,费时费力,时间增长也会导致吸入更多电转液中挥发出的甲醇,总之两个字:不爽!
现在出国了做Western blot比较多,发现有很多改进的地方,归纳如下,希望对战友们有所帮助,如果觉得真的有用,帮忙把帖子顶一下!
1、做电转时,滤纸、胶和PVDF膜的尺寸不必绝对一致。只要滤纸>=PVDF膜>=胶就行了,不会短路的,我做过多次了!PVDF膜可以事先按胶的尺寸裁剪好,当然也可以直接买现在的,看银子多少而定了。
2、因为不需要剪滤纸,所以赶气泡的活就是a piece of cake了。只需要依次把平衡好的胶和膜放上去就行了,只要没有气泡,不要不停地用玻棒等去赶气泡了,不然胶容易变形,出来的蛋白质条带会变弯的。
3、电转液是可以重复使用的!虽然使用久了的电转液在电转的过程中发热情况会比较厉害,但效果依然不错,我好象都用了十几次了还可以继续使用呢,这也是比较节约银子的了,而且不用总去配试剂啊,省事!
暂时把最有用的几招写在这里,希望对你有用!
顶部
tie8[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75844
精华 0
积分 442
帖子 543
信誉分 100
可用分 3571
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
2
 
谢谢分享,1、2、3点基本符合实验原理,可以为人接受。相信有不少战友在使用。
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3
 

"只要滤纸>=PVDF膜>=胶就行了,不会短路的,我做过多次了!PVDF膜可以事先按胶的尺寸裁剪好,当然也可以直接买现在的,看银子多少而定了。"
这种说法不准确,准确的说应该是恒压法适用,衡流法不适用。
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
4
 
做电转时,滤纸、胶和PVDF膜的尺寸不必绝对一致。只要滤纸>=PVDF膜>=胶就行了,不会短路的

==============================================================================================================

对于这点我也有疑问,如果浸泡电转液的上下滤纸接触了,那么在接触的地方电阻就会变小,电流就会选择从电阻较小的地方通过即我们所说的“短路”,之所以转膜还会成功,一是由于还是有小部分电流通过,二是随着转膜的进行,产生的热量会使电转液逐渐消耗,原来的“短路”处的电阻也增大,会使的分配到胶上的电流重新增大。但是这样的话必然会使转膜效率降低,而且更严重的是会损坏电转仪(我们实验室曾发生过这样的情况)。
顶部
gogo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
5
 
同意楼上的观点,滤纸不宜过大,容易出现短路,轻者影响转膜效率,重者损坏电转仪。
顶部
october7[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77254
精华 0
积分 448
帖子 616
信誉分 100
可用分 3856
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
6
 

偶也同意,偶的师兄就告诫,说滤纸不能比胶大,容易短路,当然是恒压,恒流没试过
顶部
wawa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71235
精华 0
积分 440
帖子 560
信誉分 100
可用分 3618
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
7
 
对于这点我也有疑问,如果浸泡电转液的上下滤纸接触了,那么在接触的地方电阻就会变小,电流就会选择从电阻较小的地方通过即我们所说的“短路”,之所以转膜还会成功,一是由于还是有小部分电流通过,二是随着转膜的进行,产生的热量会使电转液逐渐消耗,原来的“短路”处的电阻也增大,会使的分配到胶上的电流重新增大。但是这样的话必然会使转膜效率降低,而且更严重的是会损坏电转仪(我们实验室曾发生过这样的情况)。

==============================================================================================================

恒压法不存在这样的问题,而且一般高级的电源都有短路保护,如果正负极短接会立即开路的。伯乐的Trans-blot semi dry transfering cell操作手册上提供的是恒压的方案,也并没有关于严格的滤纸,膜,胶的大小的规定。只是说了膜要大于胶,否则胶多出来的部分不会转到膜上(这个是当然的了)。
顶部
zhenxin[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76024
精华 0
积分 748
帖子 1216
信誉分 100
可用分 6848
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-31
状态 离线
8
 

转膜是个多次讨论的宽松话题。
大家说的都各有道理,而且也都在实践中使用,有的更加流行(比如半干恒流)。
我的一项观点是:为保险起见,各层尽量一致大小(操作时可据经验把胶稍微切大一些,因为胶进入转膜缓后由于甲醇的固定作用胶孔变小会稍微收缩,滤纸和膜一致即可)。
如不一致,则电极板-滤纸-胶-膜-滤纸-电极板任何非相邻层面不要有直接接触为最高原则。
顶部
雪花子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72953
精华 1
积分 259
帖子 194
信誉分 102
可用分 1776
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
9
 
我都没有剪滤纸,尺寸和海绵一样大,直接使用都没有问题啊。电转液使用多了发热是否是因为甲醇挥发了的原因呢?应该不存在短路的问题,不然仪器设计就有问题了。另外,如果说“在接触的地方电阻就会变小,电流就会选择从电阻较小的地方通过即我们所说的“短路””,那海绵总是会直接接触的吧?那岂不是早就短路了?!欢迎讨论啊!
顶部
nikonun[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107972
精华 0
积分 218
帖子 176
信誉分 100
可用分 1636
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
10
 

楼主写的是湿法转移吧 这样对半干不使用的
顶部