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标题:【求助】冻蛋白和冻组织,哪一种方法对磷酸化蛋白...

XYZQ[使用道具]
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【求助】冻蛋白和冻组织,哪一种方法对磷酸化蛋白...


由于近期到了处理模型动物的时候,提取大鼠下丘脑组织中的总蛋白。可又面临诸多实际问题,致使2~3个月内无法用所提蛋白做有关磷酸化蛋白的western。请问:针对磷酸化蛋白,我是先提取蛋白后-80°C保存蛋白好还是先-80°C保存组织后提取蛋白好,即冻蛋白和冻组织,哪一种方法对磷酸化蛋白的保存更有利?
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bling[使用道具]
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个人感觉冻蛋白更好
蛋白提取后尽快定量分装成多个小管,使用时再取出所需蛋白即可
尝试过超过1年的组织保存,感觉再提取后分析结果不是很好
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冰儿0109[使用道具]
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冻蛋白好些,收集完成后马上变性并于负80度保存,以保证降解程度最小;同时还要最好分装保存,防止反复冻溶,容易磷酸化降解!
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XYZQ[使用道具]
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楼上你好!你所说的“马上变性”是指蛋白定量,分装后,用100°C热变性吗?还加不加loading buffer?
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jingling845[使用道具]
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根据我们的经验,加loading buffer煮沸变性后-80度保存。
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tie8[使用道具]
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本人不完全同意楼上的说法。首先,“针对磷酸化蛋白,我是先提取蛋白后-80°C保存蛋白好还是先-80°C保存组织后提取蛋白好 ”这种保存组织的方法就不是最合适的。通常我都会建议学生以最快的速度准确取下组织后,马上冻存在液氮中(用小的液氮罐或者稍大一点的保温杯装满液氮),待组织快速冻存后再转移到-80°C保存,这样才能组织能够保存最长的时间。其次,不变性的蛋白提取物比变性的能保存更久。比如说,是生肉冻存保存得更久,还是熟肉冻存保存得更久?当然是生肉。非变性蛋白在-80°C超过2 m肯定没问题,变性后就短得多,具体时间我并不清楚,是一个海龟告诉我的,所以我一直是这样做的。
顺便多说几句,我不清楚为什么取材后不马上检测。不论是什么检测,材料越新鲜越好,这是公认的。所以一开始就应该把试验的准备工作做好,包括抗体等试剂、设备、场地、人员、试验步骤等等。否则蛋白变性了就工作白干了。这种教训是很常见的
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XYZQ[使用道具]
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我们学校7月底要搬家,全校搬,到时候有实验全都得叫停,真倒霉。
另外,我就是想了解--对于磷酸化蛋白,是冻组织好,还冻蛋白好?
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tieshazhang[使用道具]
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"以最快的速度准确取下组织后,马上冻存在液氮中"是为了避免结冰过程中产生的冰晶引起细胞及细胞器损伤,如果要低温保存组织,这个就是标准的操作方式。
冻组织和冻蛋白都有人在使用,都有各自的优势,比如后期实验,裂解液和抑制剂成分,变性的作用等等都可以考虑,这是个开放和争执的话题,不必迷信任何一方,希望大家能够继续深入讨论。
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laughing妹[使用道具]
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我建议先提取蛋白后-80°C保存蛋白.
但要注意冷冻的操作方式。
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