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标题:【求助】哪些条件可能造成本来可溶的重组蛋白表达形成...

junhun[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】哪些条件可能造成本来可溶的重组蛋白表达形成...


我有一个别人已经构建好的大肠杆菌菌株，表达单链IgG抗体。人家表达的时候目的蛋白是以可溶形式表达，我用同样的条件重复操作，结果表达蛋白始终在沉淀中，不知道是什么原因造成的。表达条件如下：
1.30C，50ml 2*YT+Amp+Chl+1%葡萄糖，过夜培养，至OD600为1.4左右
2.3000rpm 离心10min收集菌体后，用25ml 2*YT+Amp+Chl重悬菌体，加入1mM IPTG 30C诱导4小时。
3.3000rpm 离心10min收集菌体，加入2.5ml Novergen公司的Bugbuster破碎液室温破碎细胞1小时。
4. 4C，18000rpm离心40min 收集上清，用2.5ml PBS重悬沉淀，上清、沉淀同时跑SDS-PAGE和Western检测，蛋白条带在沉淀中。
由于是人家已经研究过的条件，因此我目前都只是做重复。对于试验中的操作我有几点疑问：
1.诱导前OD值过高是否有影响，我也曾经做过过夜只有0.8左右的，结果一样。
2. 我使用的培养基PH为7.0，但是过夜培养后检测PH为5.5。我用的 是Oxid的培养基，连NaCl和葡萄糖都换成Sigma的了。对方用的是Difco的培养基。
请大家帮忙分析一下
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很可能的，影响因素太多，不同实验室并不是太容易完全重复，比如连用水都不一定一样吧，应该需要重新摸索。培养基有很大影响、OD也是
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发表于 2014-4-21 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导前OD可能会影响表达量的高低，但是对蛋白表达的形式影响不是很大。与发酵不同，在摇瓶培养的时候一般都是忽略pH变化的，所以我感觉pH变化的影响也不大。
不知楼主诱导温度和转速是多少，如果想使可溶性表达最大化，主要采用的就是降低诱导温度和转速，你可以用不同的诱导温度做个对照；你应该再咨询一下他们破菌的条件，也许是你的破菌条件不同，使得可溶性表达的蛋白也留在沉淀中，使你误认为是包涵体表达了。
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在的培养用的物质全都是进口试剂了,水也换成超纯水了.
温度目前我做到30度,
破碎条件用过细胞破碎仪破碎做对照
所有结果都不理想, 真是郁闷啊
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白表达影响因素确实非常的多，用Bugbuster是最温和的细菌破碎方法，也非常贵，你可以先用少量细菌（1ml）进行破碎研究，确定蛋白表达情况后再大规模裂解，对于可溶性表达，不同实验室条件不一样，建议你自己摸索一下，注意以下几点：
1：细菌要重新转化的，在平板上生长不超过24小时
2：诱导OD你采用0.6，太高不是很好。操作过程：过夜培养2ml细菌（多选几个克隆，培养液里含葡萄糖），12小时--16小时后1/100转接到50ml培养基（不含葡萄糖），220rpm37度培养3到4小时，OD0.6左右，冷却细菌致20度，加IPTG ， 在20--25度诱导，Bugbuster破菌，电泳检测
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49888[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
营养过剩
高温，过表达，营养过剩这3个应该是主要原因
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位．
我的均是人家已经构建好，经过表达纯化无问题后拿过来的，我的诱导条件也是采用他们已经研究好了的．但是现在就是无法重复
我现在设计实验降低温度和ＩＰＴＧ浓度看一下结果，具体结果尽快向大家汇报．
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发表于 2014-4-21 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，我的理解，你把培养基中的葡萄糖改成2g/l葡萄糖，或者不用葡萄糖培养到OD=1.0左右，进行诱导，培养4~8小时后测定表达
因为培养基中含有1%葡萄糖也就是10g/l葡萄糖，浓度太高，在摇瓶条件（通氧以及搅拌）条件下，葡萄糖是消耗不完的，因为很容易产生葡萄糖效应，因此你的发酵液的pH为5.5，产生的乙酸会抑制你的菌体生长以及表达。而且许多表达的大肠杆菌在培养基中有葡萄糖的情况下，是不会诱导表达的
据我猜测，你所说的别人做好的条件，也许是发酵罐上的条件，发酵罐上的可以控制溶氧和pH，一般在6小时左右（视菌体不同）10g/l葡萄糖可以消耗完，而根据我的实验10g/l葡萄糖摇瓶培养过夜，葡萄糖也消耗不完.在发酵罐上如果pH控制在6.0，乙酸效应很明显，菌体生长就很慢了
你可以参照这个思路作以下
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-4-21 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人观点：1.不加葡萄糖或降到很低浓度，避免葡糖效应。2、超声破碎要完全，否则蛋白会在沉淀中。3、 OD在0.4-0.6时诱导，低温，慢速。
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