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标题:【求助】关于梯度PCR问题

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发表于 2014-4-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于梯度PCR问题

梯度PCR结果如下：
上面一排是阳性对照，下面一排是一般标本。根据电泳图，我选择了50度作为最佳温度。

[ 本帖最后由 iii_ii 于 2014-4-25 16:45 编辑 ]


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发表于 2014-4-21 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天做标本结果如下，阳性的还是阳性，最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。
问题：我根据梯度PCR选择的50度做为退火温度，为何还是出现细的条带？
是否需要选择更低的退火温度？减少cycles？


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发表于 2014-4-21 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原始protocol是 94C 2 min， 94 C 30 sec， 58C 1min， 72C 1min， 36cycles； 72C 7min， 4C hold。跑出的条带和我用50C退火温度跑出的条带基本一样，阳性对照很量，但是阴性的都有一条细线。
我做梯度PCR以58为中心，其他条件没变，在53.5 和56.1的温度时对照出现细条，所以最后选择了50度做最佳退火温度，是否正确？
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发表于 2014-4-21 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天用48度的退火温度，30cycles再做了一次，最后一条是阳性对照，前面样本还是有3条出现了细条，不知道原因，大家请帮助分析一下。


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发表于 2014-4-21 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天做了southern blot 电泳，目的条带大概是700bp。marker用的是1kb。
不明白胶照相显示上半部分背景很亮，目的条带都没看见，下半部分看起来酶消化应该还可以。这种情况是啥原因？目的条带有没有可能处于上半部分，未显示？
图片如下：
......


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发表于 2014-4-21 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Southern 的电泳？不是把基因组DNA酶切吗？不知道你的酶切是怎么设计的，是不是正好把目的基因的700bp条带切出来？
1Kb marker 是哪个公司的？TAKARA的跟你的好像不太相符。
能指出每个条带代表的分子量吗？
样品中很亮的条带不是你的目的条带吗？
你再给些具体信息吧
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发表于 2014-4-21 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉没700bp呢
说哈实验背景撒
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发表于 2014-4-21 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mouse tail DNA 10 ul ，用 Eco RI 1.5ul 在37度消化2小时以后，再加 Eco RI 1ul 过夜消化。
1％agarose ＋ 7.5 ul EB 跑胶， marker是1kb的ladder，电压115，时间2.5小时
希望的目的条带是700bp。
目的条带应该在上半部分，但是上半部分背景很亮，没看到。
下面很亮的不是我要的目的条带，而且第3、4、5、14、15、17条最后有滴状高信号的是啥呀？
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 小中大
1kb的marker是1－10kb共10条带吧？但目的条带700bp怎么应该在上半部分？是不是100bp的marker哦？
电泳时间太长。
胶好像也有问题，是不是电泳前有点干了？
mouse tail DNA 进行了 Eco RI 酶切位点分析没有。 Eco RI 很好切的，加的多了，而且时间长了。感觉是切碎了。
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 小中大
700 bp相对于整个gDNA来说，占的比例太少了！如果是这样，load的量要相当大才能看到，而且背景应该是相当高。高频酶切出来是弥散的带，不知道EcorI切割的频率有多高。
同位素的检测灵敏度很高，所以即使看不到带也可以检测出来。
如果实在想看，我觉得至少要将很亮的非目的区域的带切掉。前面的带是不是RNA？因为我认为EcorI切了后应该不可能有大量分子量相当的DNA片段才对，毕竟不是质粒啊，whole genomic DNA。
没做过southern，班门弄斧，权当参考
......
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