【求助】2-DE两胶图,请大家帮忙分析问题

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标题:【求助】2-DE两胶图,请大家帮忙分析问题

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人做的是宫颈癌细胞和宫颈永生化细胞核蛋白的差异比较.实验进行了两个月,总的来说问题就是胶面点比较小比较淡.下面我传上两张胶及操作步骤,请大家帮忙分析分析.
1.蛋白提取:merke公司的亚细胞器蛋白质组抽提试剂盒,之后丙酮沉淀
2.IPG预制胶条（18cm pH 3-10）,上样量340ul/750ug.水化液泡涨12小时(尿素7M/硫脲2M/CHAPS4%/DTT65mM/IPG缓冲液0.5%/溴酚蓝痕量）
3.等电聚焦:GE公司Ettan IPGphorⅢ等电聚焦系统(200v/500v/1000v各一小时,8000v36000vhr,10000v22000vhr)
4.平衡胶条: 尿素6M/SDS2%/Tris-HCl0.375M (1.5M pH8.8 Tris-HCl）/甘油 20%/DTT0.1g×15min,0.125gIAA替换DTT×15min
5.SDS-GAGE电泳: 安玛西亚公司电泳仪,12%SDS聚丙稀酰胺拧胶在电泳液(25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）电泳8小时
6.银染(方法参考郭晓君<蛋白质电泳技术>Wink
先是癌细胞的:

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2014-4-26 16:31

22635477.snap.jpg (19.12 KB)

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发表于 2014-4-26 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这张是永生化细胞的

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2014-4-26 16:31

98774826.snap.jpg (20.46 KB)

=pkchen=[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两张胶差别可够大的.
这两个细胞系建系来源差别大吗?
第二张图跑的还算不错.
我没做过核蛋白质,里面的碱性蛋白质是不是多点,
但是你的图上好象不怎么明显.
看看相关资料,找点对碱性蛋白质比较好点方法试试.
有很多这样的文章发表的啊.
胶浓度是不是还可以降低点?
点小我觉得没什么问题,
点淡估计与你的染色方法及试剂的纯度有关.
上样量340ul/750mg??

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.癌细胞是caski细胞,永生化细胞是国内一个实验室自己建株的宫颈鳞状上皮细胞.我觉得两细胞的差别类似与临床上的鳞癌和CIN.
2.关于碱性蛋白的问题,也是我烦恼之一,碱性蛋白总是聚不上去,我的电压总数都是在60000vhr左右,DTT也用了,提蛋白的试剂盒也用了benzenase.
3.银染是我们自己配的试剂,甲醇/乙醇/冰醋酸/碳酸钠/硫代硫酸钠都是用的国产的分析纯,硝酸银是在生工订的.每次操作硝酸银我都注意闭光了的.
4.之前跑的癌细胞核蛋白一直点很淡很小,我以为可以通过增加上样量来改变这个问题,现在看来是错误的.
5.merke公司的亚细胞器蛋白质组抽提试剂盒可以顺序提浆/膜/核/骨架四种蛋白,我用同样的操作跑过胞浆蛋白,得到效果很好的图.由于我查到的相关核蛋白2-DE的资料很少,不知道最适胶浓度,请=pkchen=多多指点!

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今晚又染了一块胶,彻底崩溃了~~~
酸性区几乎就没什么点,还不如以前跑的,问题到底在哪里?
各位朋友帮帮忙啊!!!

remonte[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两块胶比较起来差别很大。
要是重复跑胶的话相同样品的重复性比较好的话，是否可以考虑是样品提取方面的问题？
点淡及小我觉得可能跟你的样品本身有关系。
还有我觉得可以缩小胶的pＨ范围。

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

昨天又跑了一次，样品水化后定量，上样量280ug/340ul，17cm胶条。泡涨12h，聚焦60000vhr，平衡，跑SDS-PAGE之后银染都和以前一样，刚刚出结果，胶上出了maker清晰以外，只在碱性区有几个淡淡的点。
分析失败原因，翻阅了最近的实验记录，实验出现过这样一个情况：胶条从-20度取出外观正常，水化后厚度均匀，而聚焦完成后酸性区变厚，碱性区很薄，二向的时候酸性区没有明显的溴酚兰指示线，而是成一条淡淡的弥散状的兰带。
从用伯乐的IPG胶条以来就出现酸性区点淡而小甚至没有点的情况，最严重的是今天居然整个胶片几乎没什么点。不知道大家遇到过这样的情况没有？会不会是胶条有问题。
PS：上面第二张图是用安玛西亚的胶条跑的。

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发表于 2014-4-26 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不是教条的原因,问题在样品的抽屉上,点淡是还原不行,建议用巯基乙醇先煮下.
酸性与核蛋白有关,核中的当然是碱性蛋白多才好和核酸结合呐,多看书多看书

dreaming[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你把胶条放在-20度的原因是什么？
如因为跑完一向是在晚上，为了要过夜，那我告诉你一个经验：
聚焦完成后，500V低电压继续维持12小时过夜，这样会有利于酸性端蛋白的聚焦效果，但对碱性端略有不利。
此外，银染结果淡可能有以下几点原因：
1．加入硝酸银之前，水洗的步骤，每次时间要短，严格控制在1min之内（算上换水时间），洗四次。
2．可适当多加一点甲醛。
祝实验顺利。

utt0989[使用道具]
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发表于 2014-4-26 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把缓冲液调过来有利于碱性蛋白的分离。