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标题:【求助】溴酚蓝不成一条线，啥原因？

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-4-26 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】溴酚蓝不成一条线，啥原因？


各位战友，为什么我的蛋白上样电泳时溴酚蓝总是呈一堆（象磨牙的形状），而不是呈一条线，上样缓冲液和其他人共用，只有蛋白不一样，我的蛋白是组织的蛋白，已经提过三次了，还是如此，裂解液也换过了，百思不得其解。我现在用的是15％的胶，蛋白分子量约13kd，换20％的胶更为明显，呈一条很宽的线，不知道是否跟胶有关，还是跟其他原因有关，请各位大侠帮忙分析一下。已经摸了好久的条件了，小分子量的蛋白总是显示不好，杂带非常多，大部分都是大分量的，20一下的基本没有，郁闷啊。
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发表于 2014-4-26 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的是11KD多，最近跑胶的时候也总是出现这种情况，正一筹莫展呢
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发表于 2014-4-26 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白过宽可能是浓缩胶的问题吧
或者压分离胶的时候没压平
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发表于 2014-4-26 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主最好把提蛋白到上样跑胶的PROTOCL写出来，这样才好给你建议哈：）
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发表于 2014-4-26 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
溴酚兰可能不纯，那0.22um滤气过滤一下试试。
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-4-26 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白提取换了两种蛋白裂解液，一种是师姐留下的，一种是借实验室其他人的，5×loading buffer 用时加DTT，这些是实验室一起共用的，别人做的都非常好，跑胶时成一条线，非常漂亮，唯一不同的是我的蛋白是从组织中提取的，他们的是从细胞提取的，我的胶是15％的，他们的是12％的，分离胶的配方如下(10ML)：H2O 2.3ml，30％acrylamide 5ml，1.5MTris（PH8.8）,10%SDS 0.1,10%AP 0.1,TEMED 0.004。请高手指点啊，多谢了。
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发表于 2014-4-26 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近刚好在做小分子蛋白（7 kD）的Western预实验已经做出来了。
楼主提到的情况，我也遇到过。
我用的是20%的胶，在浓缩胶里面，蛋白条带可以跑得很好，但是到了分离胶以后，发现溴酚蓝跑成一条很宽的带，最上面的那部分呈磨牙状，而最下面那部分是一条平整的线。整个溴酚蓝条带跑成 1 cm。
一开始我也百思不得其解，但是最后小分子蛋白的条带出来了。而且还不错，目的条带有轻微的“微笑”，考虑到我们没有专门的冷却系统，我觉得条带应该还算可以。
扯远了，再说溴酚蓝。我觉得用20%的胶产生宽的、磨牙的溴酚蓝条带应该是正常的。因为20%的胶本来就是用来分离小分子蛋白的，我们用的溴酚蓝是国产的，不是很纯，我想跑在上面的溴酚蓝应该是分子量比较大的溴酚蓝聚合物，跑在下面的是纯的溴酚蓝——当然这是主观猜测的。
因为溴酚蓝在电泳中只是一个指示剂，我觉得溴酚蓝跑成宽带应该不影响目标蛋白，楼主完全可以不去理会溴酚蓝的问题。
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发表于 2014-4-26 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为我的条带小分子量的总是不好，上面大分子量的则跑的还可以，所以我想loadingbuffer会不会影响结果。如果没有影响结果的话最好了。但是为什么其他人的都不是这样，就是因为胶的浓度吗？那我就这样做吧，谢谢了。
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发表于 2014-4-26 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

组织样品最好煮沸后离心取上清上样，效果会好些。
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发表于 2014-4-26 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵 ,溴芬兰不成一条线是吧?!看到好多人问这个问题了
这主要和你的上样缓冲液(离子浓度,PH)或是胶有关系,
我跑SDS-PAGE的时候,起先溴芬兰也是宽的一条,到后来才能压成一条直线,
但是并不影响电泳和暴光的条带,
然而在胶里加了甘油之后(我用的是loading buffer是含8M urea, tris, glycine,DTT的,ph8.8),
极其可能LOADING BUFFER的PH和分离胶的PH一样(我跑的是连续的/),也有可能是胶里加了甘油,我还没有验证过,溴芬兰压的相当直, 一个孔就是一个孔,孔间绝对没有粘连,就象暴光出来的条带那样整齐.
下次等我跑胶时,拍个照片传上来/
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