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标题:【求助】离子交换，30mM和100mM的PBS洗脱（图）

pencil菲[使用道具]
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发表于 2014-4-26 21:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】离子交换，30mM和100mM的PBS洗脱（图）


RT
直接用30mM洗脱，那30mM之前的蛋白不也跟着一起下来了吗？我该怎样理解？
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-4-26 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

此句的前后文呢？
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nikun230[使用道具]
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发表于 2014-4-26 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有前后文，只能猜，我猜想估计是离子交换层析中目的蛋白的馏分在３０－１００mＭ之间吧．
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发表于 2014-4-26 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bangqi_k 于 2014-4-26 21:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

此句的前后文呢？

The protein solution was applied to a column
(5 cm X 100 cm) of DEAE-cellulose and washed with 10 mM
sodium phosphate buffer, pH 7.0. Then it was eluted with 6
L of 30 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, followed by
100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Assay for enzyme
activity showed the presence of two peaks of enzyme activity,
one eluted by the 30 mM buffer and the other eluted by the
100 mM buffer.The most active areas about each
peak were pooled and labeled fractions A and B, respectively.
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发表于 2014-4-26 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
此文的意思是：
30mM 和 100mM 洗脱的组分都检测到酶活性，将两个组分分别收集，标记为组分A 和 B。
至于两者是否为同一物质，并未说明。
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发表于 2014-4-26 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bring 于 2014-4-26 21:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
此文的意思是：
30mM 和 100mM 洗脱的组分都检测到酶活性，将两个组分分别收集，标记为组分A 和 B。
至于两者是否为同一物质，并未说明。

嗯，谢谢。那回到我的问题初衷：我先用10mM，直到检测到的蛋白组分基线水平。然后我直接换30mM的洗脱？是这意思吗？
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发表于 2014-4-26 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正确。
这是常用的生产方法，简单，便于操作，也不需要复杂的梯度生产系统，手动的或简单的自动系统就可完成。
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发表于 2014-4-26 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bring 于 2014-4-26 21:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

正确。
这是常用的生产方法，简单，便于操作，也不需要复杂的梯度生产系统，手动的或简单的自动系统就可完成。

稍微明白了，谢谢。
我在AKTA上操作。1）意味着直接用30mM洗脱，直到与基线平行，最后只收集那些有活性的收集管？还是，收集全部的收集管？
2）我想改用某浓度的NaCl+10mM PBS混合洗脱，那摸索处具体的洗脱浓度怎么就那么难那？
我是这样做的，先用0.5mM NaCl+10mM PBS梯度洗脱，然后看哪个洗脱浓度（当然通过电导得出的洗脱浓度）下比活性大，就选取哪个浓度作为洗脱。
问题是，我现在用100mM的PBS梯度洗脱得不到文献上所说的那两个浓度，而是只有一个洗脱峰，这个洗脱峰里比活性最大的2个电导处，非文献上所说的30mM和100mM，怎么解释呐？谢谢
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发表于 2014-4-26 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个问题回答起来话就长了！
简单说来，任何吸附都不是绝对的，即，它是一个吸附和解离的动态平衡。当吸附力强时，显示为吸附状态，当外界条件变化，导致解离力强时，则显示为被洗脱 。
而我们变化条件，进行洗脱时，都是一个渐变过程，（即使你的程序是直接的变化，如由10mM变成30mM），而渐变的过程不一样，看到的结果肯定不同，但是是可以通过分析来解释的。
就具体你的梯度和阶段洗脱的显示浓度不一致，原因为，在梯度洗脱中，当到达一个浓度，蛋白可以被洗脱时，此时蛋白质开始和介质解离，但梯度却还在继续升高，所以，伴随蛋白一起流到检测器的溶液的盐浓度，通常都大于真正所需的洗脱盐浓度。解决办法是，在方法摸索时，尽量减缓梯度变化的速度，有时 甚至会走20-40个柱床的梯度长度。
还有很多影响因素，需要学习一下相关的专业书籍，恕我不能一一表述
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发表于 2014-4-26 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

噢哦噢。在走10~20个柱床体积时是两个活性高的峰。但我有一次跑了大约40个柱床体积，一侧活性，做出图类一看，一个大大的拱桥。我都无言加无奈死了。感觉老天总在跟我开玩笑
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