现代分析实验

简介:
醋酸广泛存在于食品、果汁、造纸、制药和其他工业产品中，一个非常重要的参数，此试剂盒(K-ACET)可专门们用于测定醋酸的含量。

原理:
在乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化作用下，辅酶A转化醋酸为乙酰辅酶A，并同时生成AMP和焦磷酸(1)，在柠檬酸合酶的作用下，乙酰辅酶A转化草酰乙酸生成柠檬酸(2)，反应中的草酰乙酸来源于L-苹果酸与NAD+在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的作用下的产物，在此反应中NAD+被还原成NADH(3)。

(1) 醋酸 + ATP + CoA   (ACS)   乙酰辅酶A + AMP + 焦磷酸

(2) 乙酰辅酶A + 草酰乙酸 + H2O   (CS)     柠檬酸 + CoA

(3) L-苹果酸 + NAD+   (L-MDH)   草酰乙酸 + NADH + H+

生成的NADH的量取决于醋酸的量，NADH的吸光度值可在340下测量。

特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:
该试剂盒(K-ACET)专门们用于测定醋酸的含量。
最小可调吸光光度为0.005个吸光单位，样品体积为2.00 mL（或对于浓度为1.4 mg/L的样品测定体积为0.1 mL），若在340nm下检测,此时的醋酸浓度为0.07 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.010吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的醋酸检测线为0.14 mg/L。
该实验的测量范围为0.3-2 0μg 醋酸，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为2.00 mL，此时的醋酸浓度大约在0.07-0.14 mg/L之间，c.v.在0.6-2.8%之间， 如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。

干扰:
醋酸酯（乙酸乙酯）与醋酸经常共同存在，在试验条件下，乙酸乙酯可被缓慢的水解并造成“缓慢反应”，我们可以利用添加ACS后推测出的的吸光度值（A2），来排除乙酸酯造成的影响，在试验的16-20分钟再次读取吸光度，并使用我们提供的MegaCalcTM Excel，通过校正后的A2可以很容易的计算出醋酸的浓度，也可以当反应到达终点后（吸光度不再变化）计算出总醋酸（包括醋酸酯）浓度。
如果醋酸在试验规定的时间内（大约10-12分钟）完成转化过程，通常认为没有干扰发生，通过向已完成反应的试管中添加醋酸（0.1mL中添加10μg），进一步的验证实验，吸光度值还将进一步增加。
利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加一定量的醋酸。

安全性:
醋酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。

试剂盒:
Megazyme醋酸测定试剂盒可以进行53次的测定试验，并提供有全部的试验方法：
瓶1: TEA缓冲液 (30 mL, 0.8 M, Ph8.4) + L-苹果酸(60 mM)+氯化镁(20 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶2: NAD+(67mg)+ ATP (137 mg)+ CoA (9.8 mg)；冻干粉
稳定性> 5年，-20°C保存。
瓶3: L-苹果酸脱氢酶(1250 U/mL)+ 柠檬酸合酶(180 U/mL)，悬浮液1.1 mL,
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶4: 乙酰辅酶A合成酶(ACS)，悬浮液(1.1 mL,90 U/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶5: 醋酸质控(5 mL, 0.10 mg/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。

试剂制备:
1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。
2. 用5.5mL 蒸馏水溶解瓶2，按照试验用量分装到聚丙烯试管中，使用期间存放于冷藏箱或冰盒中，保存于-20°C下稳定性> 2年。不要同时溶解2瓶，除非需要。
3 & 4. 准备瓶3和瓶4溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。稳定性>2年，4°C保存。
5. 备用试剂盒中的瓶5溶液随时使用。
注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用乙醛标准质控溶液进行测定，通过测量NADH的消光系数而计算醋酸的浓度。

实验需要的设备:
1. 玻璃试管(圆底; 16 x 100 mm).
2. 比色管(1 cm light path, 3.0 mL).
3. 微量移液器(20和100μL).
4. 连续分配器
5. 分析天平.
6. 分光光度计340 nm.
7. 漩涡混合器
8. 定时钟
9. Whatman No.1和GF/A玻璃纤维(9 cm)滤纸

操作步骤:
波长: 340 nm
比色杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)
温度: 25°C
最终体积: 2.84 mL
样品溶液: 每个比色杯中含有0.3-20 μg 醋酸（存在于0.10-2.00 mL样品溶液中）
空白调 0：相对于空气或者水
溶液     空白管     样品管
蒸馏水(~ 25°C)
样品
溶液1(TEA缓冲液)
溶液2(NAD+ /ATP/CoA)     2.10 mL
—
0.50 mL
0.20 mL     2.00 mL
0.10 mL
0.50 mL
0.20 mL
混合*，在反应大约3分钟后读取溶液的吸光度值(A0)，然后立即添加下列试剂继续反应
悬浮液3(L-MDH/CS)     0.02 mL     0.02 mL
混合*，在反应大约4分钟后读取溶液的吸光度值(A1)，然后立即添加下列试剂继续反应
悬浮液4(ACS)     0.02 mL     0.02 mL
混合*，在停止反应后（大约12分钟）读取溶液(A2)的吸光度值。如果12分钟后反应没有停止，每间隔4分钟读取一次吸光度值直到20分钟，使用MegaCalcTM Excel计算“缓慢反应”。

* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒


计算:
在最初的快速反应后，如果样品的吸光度值（A2）缓慢增加，通过在16和20分钟附加读取的吸光度值输入MegaCalcTM Excel，可以计算出“缓慢反应”速率。
分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A1-A0)和(A2-A0)，按照下面的公式计算出ΔA醋酸：
ΔA醋酸 =
(A1-A0)2样品                         (A1-A0)2空白
(A2-A0)样品                 (A2-A0)空白
(A2-A0)样品                         (A2-A0)空白

按照常规ΔA醋酸 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。

醋酸的含量可以依照下列公式计算:
C = V x MW   x  ΔA醋酸   [g/L]
εx d x v
注释:
V   = 最终体积 [mL]
MW = 醋酸分子量[g/mol]
ε = NADH在340 nm下的消光系数
= 6300 [l x mol-1 x cm-1]
d   = 比色管管径 [cm]
v   = 样品体积 [mL]

简化公式:
C =   2.84 x 60.05     x ΔA醋酸   [g/L]
6300 x 1 x 0.10
= 0.2707 x ΔA醋酸         [g/L]

如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。

当被分析的物质为固体或半固体时，醋酸含量(g/100 g)依照下列公式计算：

醋酸含量   =       C醋酸   [g/L 样品溶液]   x 100   [g/100 g]
样品重量 [g/L 样品溶液]

注意：使用Mega-CalcTM计算结果，会更加方便快捷

制备样品:
1. 稀释样品.
比色杯中（如：分析0.1 mL的样品）的L-乳酸含量必须在0.-20μg之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.03 -0.20 g/L之间。
估计L-乳酸浓度(g/L)     蒸馏水稀释     稀释系数F
< 0.2
0.2-2.0
2.0-2
>20     不用稀释
1 + 9
1 + 99
1 + 999     1
10
100
1000

如果ΔA醋酸 的数值太低(如< 0.100)，可以增加称量的样品量或不要进行过分稀释，也可以增加比色管中的样品量到2.0 mL，只要确保样品、蒸馏水和溶液6的总量在2.1 mL即可。

2. 操作注意事项
醋酸具有挥发性，因此在烘干或加热含有醋酸的样品时，必须谨慎处理，可以用1 M NaOH或KOH调节pH到大约7.5转换醋酸为其盐的形式最大限度的减小挥发性（如：醋酸钠或醋酸钾）。

3. 净化样品.
a. 溶液:
Carrez I溶液：溶解3.60 g亚铁氰化钾{K4[Fe(CN)6].3H2O} (Sigma cat. no. P-9387)到100 mL的蒸馏水中，室温保存。
Carrez II溶液： 溶解7.20 g硫酸锌(ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) 到100 mL的蒸馏水中，室温保存。
氢氧化钠(NaOH, 100 mM)：溶解4 g NaOH到1 mL的蒸馏水中，室温保存。

b. 步骤:
吸取液体样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，或称取足够量的样品到含有60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，加入5mL Carrez I 溶液、5mL Carrez II 溶液和10mL NaOH溶液(100 mM)，然后充分混合，补液至刻度线，混合并过滤。

4. 总则.
(a)     液体样品: 清澈的或稍有些颜色的，pH大约为10.0的液体样品可以直接检测。
(b)     酸性样品: 如果样品为未被稀释的> 0.1 mL酸性样品（如有葡萄酒或果汁），必须用2 M NaOH调节pH到大约8.4，然后在室温中孵育30分钟。
(c)     含二氧化碳样品: 样品中含有大量的二氧化碳，如：啤酒，必须用2 M NaOH调节pH到大约8.4，并缓慢的用玻璃棒搅拌。
(d)     有颜色的样品: 测试中附加样品空白，如：不含有ACS的样品。
(e)     重颜色的样品: 如果未经稀释的样品颜色非常深，需要向每10mL的样品中加入0.2g PVPP，充分搅拌5分钟，然后过滤。
(f)     固体样品: 加入蒸馏水均质或粉碎固体样品，然后过滤。
(g)     样品含有脂肪: 需要用超过脂肪沸点的水进行提取，如：将100mL容量瓶调节到20°C，并补液至刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的几mL滤液，选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。也可以选择使用Carrez 溶液进行澄清。
(h)     样品中含有蛋白: 使用Carrez溶液去除样品中的蛋白。

样品处理事例:
(a) 测定葡萄酒中的醋酸含量
对于白葡萄酒取0.10 mL直接进行测定，含酸量低的葡萄酒可以可以增加测试体积到2.0 mL。
对于含量大约0.2g/L醋酸的红葡萄酒，不需要进行脱色处理，取0.10 mL直接进行测定。
对于含量低于0.1g/L醋酸的红葡萄酒，每10mL的样品中加入0.2g PVPP，充分搅拌5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤，调解pH到8.4，并将滤液体积调整为最初样液的2倍，取2.00 mL直接进行测定。
当对大样品体积进行测定的时候，葡萄酒中高浓度的酒精可能会减缓酶的活性，因此，要增加孵育的时间到20分钟，并测定吸光度值以确保反应完全。

(b) 测定果汁中的醋酸的含量
对于含有高浓度醋酸(大约0.3 g/L)的果汁样品，用蒸馏水等体积稀释，取0.10 mL直接进行测定，如果测定大体积的样品，分析前调节pH到8.4。有颜色的果汁必须按照“总则处理办法(e)”进行脱色，取0.10-2.00 mL样品进行测定（测定大体积的样品，分析前必须调节pH到8.4）。如：对0.1mL未经稀释的滤液直接进行测定。

(c) 测定醋中的醋酸含量
测定醋中的醋酸含量，样品通常不需要处理，稀释后可直接进行测定。如：1:500倍稀释后取0.1mL直接测定。

(d) 测定酸性敷料和调味品中的醋酸含量
去除液体样品中的固体成分，添加1g样品到40mL的蒸馏水中，然后调整到100mL，4°C下保存20分钟以分离脂肪，过滤水层溶液，弃去最初的几mL滤液，稀释后可直接进行测定。如：对0.1mL未稀释的滤液直接进行测定。
(e) 测定啤酒中的醋酸含量
测定啤酒中的醋酸含量，样品通常不需要特殊处理，但需要通过过滤或强力搅拌大约5分钟，去除样品中的二氧化碳，不用稀释可直接进行测定。如：对0.2mL未经稀释的滤液直接进行测定。

(f) 测定干乳酪中的醋酸含量
准确称取2g均质的干奶酪放入到100 mL容量瓶中，加入60mL的蒸馏水，在60°C下孵育20分钟，并不时振荡，冷却到20-25°C后补液至刻度线，4°C下保存30-60分钟，然后用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，澄清的滤液可直接测定。如：对0.2mL未经稀释的滤液直接进行测定。

(g) 测定蛋黄酱或酸奶酪中的醋酸含量
准确称取5g样品放入到100 mL容量瓶中，加入50mL的蒸馏水，在50-60°C下孵育20分钟，并不时振荡，冷却到20°C后补液至刻度线，冷藏室存放30分钟，然后用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，澄清的或稍有些混浊的滤液可直接测定。如：对0.1mL未经稀释的滤液直接进行测定。

参考文献:
1.     Beutler, H. -O. (1988). Determination with Acetyl-CoA Synthetase. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VI, pp. 639-645,VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.
2.     AOAC Official Methods of Analysis (2002). 17th ed., Chapter 32, pp. 47-48.
3.     Green, A. (1971). In Biochemistry of fruits and their products. (Hulme,C. H., ed.),Vol 2, Chapter 11, Academic Press, London and New York.
4.     Chemistry of Winemaking (1964). Advances in Chemistry Series, 137, A. Dinsmoor Webb. American Chemical Society, pp. 136-137.
5.     Rankine, B. (2002). Making good wine. Pan Macmillan Australia Pty. Ltd., Sydney, Australia.