药物分析

　随着现代化工业工程技术的迅猛发展,一些现代高新技术不断被应用到中药研究、开发和中药生产中来,大大促进了中药产业的发展,使中药制药技术水平上升到一个新的高度。为进一步研究推广这些高新技术,笔者将近年来的有关情况综述如下。

　　1 　分子蒸馏( molecular distillation ,MD) 技术[ 1]

　　该技术最早由美国Hickman 博士发明,用于热敏性天然产物的分离过程,是一项较新的尚未广泛应用于工业化生产的液-液分离技术,特别适用于高沸点、热敏性及易氧化物系的分离。分子蒸馏的分离是建立在物质挥发度不同的基础上,根据分子运动理论,液体混合物的分子受热后运动会加剧,当接受到足够的能量时, 就会成为气体分子而从液面逸出,随着液面上方气体分子的增加,有一部分气体就会返回液面,在外界温度保持恒定的情况下,最终达到分子运动的动态平衡。不同种类分子的有效直径不同,故其平均自由度不同,其逸出液面后与其他分子碰撞的飞行距离不同。分子蒸馏技术正是利用此原理来实现的。轻分子的平均自由度大, 重分子的平均自由度小,若在离液面小于轻分子的平均自由度而大于重分子的平均自由度设置一冷凝面,使得轻分子落在冷凝面上被冷凝,而重分子因达不到冷凝面而返回原来液面,破坏了轻分子的动态平衡,使得轻分子不断逸出,重分子因达不到冷凝面而很快趋于动态平衡,这样就将蒸馏物质中的不同组分分离[2 ] 。

　　在国内,应用该技术纯化天然药物活性成分及单体的过程才刚刚起步。分子蒸馏是一种在高真空度(绝压0.133 Pa) 下进行分离操作的连续蒸馏过程。由于蒸馏过程中冷却真空系统的不断抽气,使整个蒸馏系统处于高真空度,从而使待分离混合物的沸点远低于常压,并且各组分在系统中受热停留时间短,因此,分子蒸馏技术尤其适合于分离高沸点、黏度大、热敏性的天然物料。一套完整的分子蒸馏设备主要包括:分子蒸发器、冷却真空系统、控制系统、加热系统、脱气系统和进料系统,整套装置的核心部分是分子蒸发器,常见的主要有刮膜式蒸发器和离心式蒸发器两种,目前应用以刮膜式蒸发器为多。

　　分子蒸馏技术已成功地应用于食品、化工、医药等行业。仅就中药制药行业而言,已有报道用分子蒸馏技术精制提纯芳香油,如桂皮油、玫瑰油、香根油、广藿香油、香茅油、山苍油等,另外,小麦胚芽油、大豆油中所含维生素E 的提纯,成熟辣椒果皮中辣椒红色素的纯化,以及银杏叶中5 种结构相似的银杏内酯A、B、C、J 、M 的分离,都取得了很好的效果。

　　2 　毛细管电泳法( capillary electorphoresis)

　　该方法又称高效毛细管电泳法,是指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。它兼有高压电泳的高速、高分辨率及高效液相色谱的高效率等优点,成为近年来发展最迅速的分离分析法之一,广泛用于中药成分分析,包括各类药效成分、中药材中主要成分及中药复方制剂成分分析。

　　高效毛细管电泳技术按基本原理主要有6 种分离模式:毛细管自由区带电泳(CZE) 、毛细管凝胶电泳(CGE) 、毛细管等电聚焦电泳(CIEF) 、毛细管等速电泳(CITP) 、毛细管胶束电动色谱(MECC) 、毛细管电色谱(CEC) ,其中,毛细管凝胶电泳法是分离效率最高的一种电泳模式。由于在毛细管内填充有凝胶,样品组分在分离过程中受到电场力和凝胶排阻的双重作用,使得组分在短柱上能实现极性的分离。毛细管凝胶电泳的样品容量为10212 g ,易于定量,可以实现自动化,也可用于大分子物质的微量制备和馏分收集。主要缺点是柱制备较困难,寿命较短。毛细管凝胶电泳法不仅可用于中药成分分析,也广泛用于生物工程领域,正在发展成为第二代DNA 序列测定仪,将在人类基因组计划中发挥重要作用。

　　毛细管电泳法与高效液相色谱法相比,在分析中草药成分时具有毛细管柱不易被污染、样品前处理简单、分析时间短、柱效高、所用化学试剂少、分析成本低、分离模式多、适合于中草药中存在的各类成分分析等优点,据报道,目前至少20 多种中药材成分分析中应用了毛细管电泳技术,并得出了适宜的分析参数。例如: 测定柴胡中的3 个柴胡皂苷a 、b1 、b2 的实验条件如下。色谱条件:毛细管47 cm ×50μm( I.D.) ,有效长度40 cm;检测波长194～252 nm;使用电压20 RV ,缓冲液30 mmol/ L 十二烷基磺酸钠(SDS) ,38 mmol/ L硼酸钠和10 mmol/ Lγ-环糊精(p H 10.0) 。样品溶液制备:取药材约1.5 g ,加甲醇15 ml超声处理3 次,每次15 min ,提取液合并,过滤,浓缩至3 ml[ 3 ] 。

　　近几年,在中药复方制剂成分分析中,该技术也得到了很好的应用,为一些中药制剂的成分质量控制提供了更为有效可靠的方法,现已有文献记载的中成药制剂有:含黄连的黄连上清丸、二妙丸、香连丸、牛黄上清丸、朱砂上清丸等;含麻黄的麻黄汤、小青龙汤、麻杏石甘汤、防风通圣散等;含黄芩的小柴胡汤、三黄泻心汤、芍药汤等;含甘草的加味逍遥散、归脾汤等。

　　毛细管电泳技术的优越性,使其应用日益广泛,随着毛细管电泳与其他技术的联用,更加拓宽了其应用范围,例如:高效液相色谱/ 毛细管电泳/ 质谱的联用,将样品处理、分离和定性三者有机地结合在一起,在分析中可以优势互补,更快速高效地提供更多的分析信息。

　　3 　高效液相色谱( high performance liquid chromatography , HPLC)

　　HPLC 是60 年代兴起的新技术,目前已广泛应用于中草药有效成分中的生物碱类、黄酮类、苷类、木脂素类、脂肪酸类、酚类等的分离,具有分析速度快、效率高、灵敏度好、选择性强、有效成分与杂质能较好地分离等优点,是中草药有效成分研究的主要方向,该技术的广泛应用为中药材的开发与质量评价提供了条件。张丽艳[4 ] 利用HPLC 法成功分离测定了喜树果实中的抗癌有效成分喜树碱;何顺志等[5 ] 从贵州产淫羊藿中分离了4 种黄酮; 欧阳强等[6 ] 报道了采用HPLC 法从枳实和枳术丸中分离出橙皮苷并测定了其含量。

　4 　高效逆流色谱技术( high-speed counter-currentchromatography , HSCCC)

　　这是当前国际上新型的液- 液分配色谱技术,它由美国国家健康研究院的ITO 博士于1982 年首创[7 ] ,近年来在天然药物研究领域独显其特色和作用。它是应用动态液- 液分配原理,利用螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合,使两相互不混溶的溶剂在螺旋管中实现高效接触、混合、分配和传递,从而将具有不同分配比的样品组分分离出来。与其他液相色谱技术相比,该技术不使用固相载体作固定相,样品在互不相溶的两相中分配,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。HSCCC 仪目前有制备或半制备型和分析型两种。影响HSCCC 技术效果的主要参数是:溶剂系统的选择。Y1 Ito 将逆流色谱溶剂系统分为三大类[8 ] :由极性小的非水相与水相组成的亲水性系统,由极性大的非水相与水相组成的亲油性系统,第三类为中间系统。HSCCC 技术的特点是:适用范围广;分辨率高且重现性好;操作简便;待分析的样品可用粗提物;没有固态载体,回收率高;能实现梯度操作和反相操作,并能重复进样, 应用价值较高。

　　HSCCC 技术在中草药成分分离分析方面的应用尚属起步阶段,近年来,随着仪器、方法的改进,国内外文献报道已利用该技术分离分析生物碱、黄酮、蒽醌、皂苷、木脂素、蛋白质、胡萝卜素类等成分。有学者从洋金花总碱中分离了莨菪碱、东莨菪碱及待定成分[9 ] ;蔡定国等[10 ] 应用该技术获得白果内酯和橙皮苷纯品,白果内酯经TLC、HPLC/ RI、MS ( E1)和IR 谱鉴定,橙皮苷经HPLC/ UV 和TLC 鉴定,均达到定量用对照品的纯度和含量要求, 表明HSCCC 是制备性分离中草药对照品的一种简捷实用的新手段。王新宏等[11 ] 利用HSCCC 技术制备苦参生物碱,使复杂样品的分离、纯化、制备可同步完成,被分离物可定量回收,在中成药工业生产中应用该技术,可望解决“用质量标准不一致的原料,生产质量标准一致的成药”这一难题。

　　5 　膜分离技术( memberanc separation technology ,MST) [ 12]

　　膜分离技术是对传统化学分离方法的一次革命。它利用化学成分间分子量差异为基础,以选择性透过膜为分离介质,当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差等) 时,原料侧组分选择性地透过膜,以达到分离、提纯的目的[13 ] 。MST 具有在分离时不受热、耗能低、无二次污染、分离效率高等特点,既可用于中药液体制剂的澄清,又可用于中药制剂的精制及有效组分、有效部位、有效单体的分离。王世岑等[14 ] 用超滤法对黄芩的有效成分黄芩苷的提取分离方法进行了考察,结果表明超滤法在收率、纯度和成色等方面均优于常规方法,而且他们对超滤法提取的最佳工艺条件进行了进一步的研究[15 ] ,结果显示选用适宜孔径的超滤膜(截留分子量为6 000～10 000) 是提高黄芩苷质量和收率的关键,同时降低药液黏度,控制药液的p H 值,可显著提高超滤速度,获得理想的提取效果。刘振丽等[ 16 ]研究对比了超滤法与醇沉法对金银花中绿原酸的影响,结果超滤体积为1125 倍时, 绿原酸得率为95.37 % ,而70.00 %的醇沉法绿原酸得率仅为67.82 % ,说明超滤法能够更好的保留有效成分。

　　6 　大孔树脂吸附分离技术( macroreticular resin attraction separation , MRAS) [ 17]

　　大孔树脂吸附技术是利用一类有机高聚物吸附剂吸附溶液中有效成分的方法,20 世纪70 年代末开始应用于中草药化学成分的提取分离。大孔树脂在中草药有效成分的提取分离及成分测定方面已显示出其独特的作用。例如六味地黄丸复方水煎提取,固形物收率为14128 % ,采用超滤与树脂分离技术连用进行纯化分离,固形物收率仅为6.40 % ,而有效成分丹皮酚约有98.00 %被树脂吸附,马钱素有86.00 %被树脂吸附,不仅明显地减少了用药量,而且有效地保留了活性成分[18 ] 。

　　7 　超临界流体萃取技术( supercritical fluid extraction , SFE) [ 19]

　　超临界流体萃取技术是近20 年来得到广泛研究和开发的一项提取分离技术。它利用一种超临界流体(SCF) 如CO2 、乙烯、丙烷、丙烯、水等在临界点附近等区域内,与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性,且对溶质的溶解能力随着压力和温度的改变在相当宽的范围内变动而实现。这种流体可以是单一的,也可以是复合的。添加适当的夹带剂可以大大增加其溶解性和选择性。该技术提取挥发组分或生理活性物质时,对提取物极少损失或破坏,无溶剂残留,产品质量高。90 年代超临界流体萃取技术被应用于中药提取分离领域,与传统方法比较,提取率明显提高,且提取物成分达到100 %的“全天然”。张忠义等[ 20 ] 用SCF-CO2 技术萃取厚朴的主要有效成分,得到厚朴酚的含量为32.91 % ,萃取率为1.73 %。付玉杰等[21 ] 用SCF-CO2 技术萃取甘草中甘草次酸,并与索氏提取法、超声法进行了比较,提取率是索氏提取法的13 倍,超声法的5 倍。

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