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标题:【求助】病毒感染的细胞，如何进行western blot？

dreaming[使用道具]
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发表于 2014-5-6 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】病毒感染的细胞，如何进行western blot？


我用病毒感染细胞后，细胞发生凋亡。现在想检测病毒蛋白的表达情况，请问：
1,如何收集样品进行western blot：是直接收集细胞上清还是将凋亡后的细胞离心下来？
2、一般需要用多大培养体系的培养基进行细胞培养，才能得到比较清楚的western blot条带？
非常感谢！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-6 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、这个要根据你的实验要求来决定，看是检测游离蛋白还是细胞蛋白。
2、一般至少要10*5才够一次，当然还要看最后的蛋白定量。一般来说目的蛋白在10ng以上为好。6孔板的话每孔给20~50ul裂解液为好。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-5-6 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wmp1234 于 2014-5-6 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、这个要根据你的实验要求来决定，看是检测游离蛋白还是细胞蛋白。
2、一般至少要10*5才够一次，当然还要看最后的蛋白定量。一般来说目的蛋白在10ng以上为好。6孔板的话每孔给20~50ul裂解液为好。 ...

阁下没理解我的意思。我不是检测细胞的蛋白，而是检测病毒的蛋白。
请问，取上清，还是取细胞进行WB?
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-6 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
病毒本身不具有翻译能力，还是要通过整合到基因组，借助于宿主表达蛋白。如果确认蛋白不是以分泌形式表达，则测定细胞是正确可行也必须采取的。若以分泌形式，则可以考虑取上清浓缩。在哺乳动物活体，凋亡不同于坏死，不激活炎症细胞引起炎症。
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发表于 2014-5-6 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用60毫米的板子，，我用多少裂解液比较好 ？
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发表于 2014-5-6 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
病毒本身不具有翻译能力，还是要通过整合到基因组，借助于宿主表达蛋白。如果确认蛋白不是以分泌形式表达，则测定细胞是正确可行也必须采取的。若以分泌形式，则可以考虑取上清浓缩。在哺乳动物活体，凋亡不同于坏死，不激活炎症细胞引起炎症。

==============================================================================================================

病毒蛋白不仅仅是分泌或不分泌表达的问题。不同的蛋白，在病毒的生命周期中其表达量是不同的。某些早期蛋白或者非结构蛋白总是在早期在细胞内表达。所以我认为兄弟的概念很笼统。还是不能解决我的问题。
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发表于 2014-5-6 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
病毒蛋白不仅仅是分泌或不分泌表达的问题。不同的蛋白，在病毒的生命周期中其表达量是不同的。某些早期蛋白或者非结构蛋白总是在早期在细胞内表达。所以我认为兄弟的概念很笼统。还是不能解决我的问题。

===============================================================================================================

相关疾病：
病毒感染
你的第一个问题是二选一，我认为我和另一位战友都已经针对性的回答了，另一位战友也回答了第二个问题，这种逻辑谁都看得出，如果不能解决你的问题，那一定不是这两个问题中的任何一个。
针对不同的蛋白，在病毒的生命周期中其表达量是不同的，那么你自己要好好查资料，没有人知道你的实验是如何设计的。从病毒感染到细胞凋亡总有一个时间的问题，查不到资料就做个时间梯度，那就是原创，空口如何套得白狼
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发表于 2014-5-6 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
某些早期蛋白或者非结构蛋白总是在早期在细胞内表达。

==============================================================================================================

相关疾病：
病毒感染
重点查你的目的蛋白的在病毒表达时期，蛋白的亚细胞定位，以及这个蛋白的半寿期，灭活方式。从病毒感染到细胞凋亡的时间。此蛋白蛋白是否与宿主细胞凋亡相关。
无资料可循那就要求你个人原创。
即使病毒以分泌的形式表达于上清而具有活性，也可以通过裂解细胞行western测蛋白的翻译量的高低。
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 小中大
而凋亡细胞则先收缩变圆，胞体变小，染色质固缩，凝集至核膜周边，成月芽形斑块状，胞浆浓缩；内质网扩张并与细胞膜融合，参与细胞表面的发泡；细胞皱缩，继之细胞内陷将细胞分割成大小不等由膜包裹的椭圆形的凋亡小体(Apoptotic body)，由临近正常细胞或巨噬细胞吞噬消除。因该过程不发生溶酶体、线粒体及细胞膜破裂，无细胞内涵物外溢，故不引起炎症反应及周围组织次损伤。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-6 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问题一：病毒的产量不好确定，我们无法给出培养体系的准确量。
问题二：病毒既然能够引起细胞凋亡，就是发生了CPE，病毒在上清中和细胞中都存在，我们的做法是同时收集细胞和上清，冻融3次后（确保病毒粒子完全释放），半透膜浓缩。电泳。
欢迎交流**
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